王風(fēng)霞，張繼，，*，高義霞，王云普

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，天水市農(nóng)產(chǎn)品深加工工程技術(shù)研究中心，甘肅 天水 741001；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070）

鎖陽（Cynomorium songaricum Rupr.）是多年生草本植物鎖陽的肉質(zhì)莖，喜生于荒漠草原帶與荒漠帶的干旱或含鹽堿的沙地上，常寄生于白刺的的根部。鎖陽具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便[1]和提高免疫力[2]的功效，在民間常作為食物蒸食，也作為補(bǔ)藥廣泛使用。研究發(fā)現(xiàn)多糖類物質(zhì)有可能是鎖陽重要的有效成分[3]。近年來，盡管鎖陽逐漸受到了醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，但與其他的植物多糖相比，鎖陽多糖的研究并不廣泛?，F(xiàn)有的研究也多以粗糖的提取工藝[4-5]、藥理活性[6-8]為主，對(duì)鎖陽多糖結(jié)構(gòu)[9-10]的研究報(bào)道極少。本工作從具有抗氧化活性的鎖陽多糖復(fù)合物中分離出2個(gè)多糖組分，本文僅對(duì)其中得到的新的可溶性多糖（Polysaccharide isolated from Cynomorium songaricum Rupr.，CSP-D1）的理化性質(zhì)、單糖組成等的研究進(jìn)行報(bào)道，為鎖陽藥用資源的研究開發(fā)及植物多糖的研究應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖陽購自甘肅省黃河藥材市場(chǎng)。DEAE-纖維素柱填料為 Cellulose DE-52（solarbio）；木瓜蛋白酶（sigma）、各種標(biāo)準(zhǔn)單糖、D-半乳糖醛酸（sigma）、H2O2、CHCl3、正丁醇、咔唑、乙酸酐、吡啶等其他試劑均為分析純：天津化學(xué)試劑一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HL-2恒流泵、BSZ-100自動(dòng)收集器：上海青浦滬西儀器廠；GPC2000高溫凝膠滲透色譜儀：美國waters公司；FTS3000型傅里葉紅外光譜儀：美國PE公司；GC-MS 聯(lián)用儀[配有 HP-5（30 m×0.25 mm×0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱及美國NIST02L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫]：美國安捷倫公司；UV1100紫外分光光度計(jì)：北京萊伯泰科科技有限公司；DT-40 TG-DTA熱分析系統(tǒng)：日本島津。

1.3 方法

1.3.1 鎖陽多糖CSP-D1的分離純化

鎖陽多糖的提取：鎖陽低溫真空烘干后，粉碎，100目過篩。70%乙醇浸泡粉末除脂，熱水浸提，濾液濃縮后乙醇沉淀，離心收集沉淀，冷凍干燥得鎖陽粗多糖。粗多糖用木瓜蛋白酶和sevag法[11-12]脫蛋白，H2O2法脫色[9]得到鎖陽精多糖。

鎖陽多糖CSP-D1的純化[13]（采用DEAE-纖維素柱純化）：100 g Cellulose DE-52，蒸餾水浸泡，再用0.5 mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCl溶液處理30 min，抽干后用蒸餾水洗滌至中性。用磷酸緩沖液處理后裝柱（1.6 cm×51 cm）。分別用蒸餾水及0～0.2 mol/L的NaOH進(jìn)行梯度洗脫，恒流泵控制流速為0.6 mL/min，自動(dòng)收集器收集，每管收集8 min，隔管苯酚硫酸法于A490檢測(cè)糖分布。

1.3.2 GPC（高溫凝膠滲透色譜）純度檢測(cè)

測(cè)定條件為 Laser wavelength：690.0 nm；Solvent：water；Flow rate：0.500 mL/min。

1.3.3 紅外吸收光譜的測(cè)定

樣品KBr壓片處理，于400 nm-1～4000 nm-1波長掃描。

1.3.4 GC-MS（氣相-質(zhì)譜法聯(lián)用）測(cè)定單糖組成

色譜柱：HP-5彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序：160 ℃保持 3 min，以 2 ℃/min 程序升溫升至210℃，保持1 min；檢測(cè)器溫度：250℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣（N2）流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量0.2μL；分流比：50 mL/min。

完全酸水解及衍生化[14]：10 mg多糖加入4 mol/L三乙氟酸（TFA）4 mL，120℃氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng) 10 h，產(chǎn)物蒸干后加入40 mg鹽酸羥銨，2 mL吡啶，90℃反應(yīng)30 min得到乙酰化產(chǎn)物。標(biāo)準(zhǔn)單糖同樣做衍生化處理。減壓蒸干乙?；a(chǎn)物，氯仿溶解后進(jìn)行GC-MS分析，并根據(jù)氣質(zhì)各峰的面積比算出百分含量。

1.3.5 TG-DTA（差熱-熱重）分析

取CSP-D1粉末2 mg左右，參比物為Al2O3，氣氛為氮?dú)?，升溫速率?0℃/min，升溫范圍：25℃～750℃。

1.3.6 糖醛酸含量的測(cè)定

糖醛酸含量的測(cè)定[14]：以半乳糖醛酸為對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（溶液濃度范圍為 10μg/mL～100μg/mL），采用咔唑法，依照文獻(xiàn)處理后使用紫外分光光度計(jì)在400 nm～800 nm掃描（以蒸餾水同法操作為參比）得最佳波長為526 nm。取CSP-D1溶液0.1 mL，同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定法分別測(cè)定其吸光值，并利用線性回歸方程計(jì)算糖醛酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎖陽多糖CSP-D1的純度分析

鎖陽多糖經(jīng)過 Cellulose DE-52（1.6×51 cm）柱層析，用苯酚硫酸法測(cè)定洗脫曲線如圖1。

圖1 鎖陽多糖Cellulose DE-52纖維素柱洗脫曲線Fig.1 Chromatogram of Cynomorium songaricum Rupr.polysaccharide on Cellulose DE-52

由圖1可知，用蒸餾水洗脫時(shí)可得1種組分，NaOH進(jìn)行梯度洗脫得另一組分。峰一收集得到的鎖陽多糖命名為CSP-D1，此組分峰形對(duì)稱。峰二的峰形較峰一偏斜程度大，本文僅做峰一的研究。

CSP-D1干燥后粉末為淺黃色，易溶于水，如圖2，GPC測(cè)得其分子量（Mn）為5.5×104。從GPC激光檢測(cè)得到的響應(yīng)曲線可見其峰形對(duì)稱，表明組分均一。

2.2 鎖陽多糖CSP-D1的結(jié)構(gòu)表征

圖3為CSP-D1的紅外光譜圖。

圖2 CSP-D1的GPC檢測(cè)（激光檢測(cè)器）Fig.2 Gel permeation chromatogram(measured with laser detector)of CSP-D1

圖3 CSP-D1的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of CSP-D1

3398.57cm-1的-OH 吸收峰，2932.25 cm-1的C-H伸縮振動(dòng)峰以及1400 cm-1～1200 cm-1左右的C-H變角振動(dòng)峰都是糖類化合物的特征吸收峰[11]；1615.77 cm-1～1442.09 cm-1處的吸收峰為C=O振動(dòng)峰和C-H彎曲振動(dòng)峰；875 cm-1為β-D吡喃葡萄糖的特征吸收峰[16-17]。

以常見的8種標(biāo)準(zhǔn)單糖做對(duì)照，以逐一進(jìn)樣與混合進(jìn)樣的方法，確定每種單糖的出峰時(shí)間，得到GCMS單糖標(biāo)準(zhǔn)圖譜，如圖4。圖5為CSP-D1的GC-MS圖譜，根據(jù)各色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間的對(duì)照見表1。

表1 GC-MS測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)單糖與CSP-D1單糖組成的保留時(shí)間及含量Table 1 GC-MS analysis of the retention time and content of standards and CSP-D1

由以上圖表可知，CSP－D1的色譜峰依次為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。各組成含量表明，其主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖組成，并含有少量的鼠李糖。其中保留時(shí)間為11.14 min的峰經(jīng)GC-MS數(shù)據(jù)庫檢索由非糖物質(zhì)形成，此峰在標(biāo)準(zhǔn)糖圖譜中同樣存在。與已有的文獻(xiàn)報(bào)道[9]不同，鎖陽多糖單糖組成中并不含核糖，此外，含量最多的不是半乳糖而是葡萄糖。推測(cè)以上結(jié)果差異是由以下原因造成的：1）材料、提取純化以及測(cè)定方法的差異都可能導(dǎo)致文獻(xiàn)與本研究中的鎖陽多糖為結(jié)構(gòu)不同的糖；2）文獻(xiàn)中的核糖是含量最少的組分，其存在與否與多糖純度及儀器的靈敏度緊密相關(guān)，即使材料中存在少量核酸，都有可能在單糖組成分析時(shí)出現(xiàn)核糖。

圖6（A、B）中分別為CSP-D1的DTA以及TG曲線。

由圖6A可知，CSP-D1的分解反應(yīng)[18]主要集中在290℃～520℃，分多步發(fā)生。100℃以下的失重由吸附水分的蒸發(fā)引起，之后的失重為多糖本身的分解。其結(jié)果分析見表2、3。從圖6B可知，CSP-D1的起始分解溫度為206.9℃，外推始點(diǎn)277.8℃。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖的GC-MS圖譜Fig.4 GC-MS spectra of Standards

圖5 CSP-D1單糖組成的GC-MS圖譜Fig.5 GC-MS spectra of monosaccharide composition of CSP-D1

表2 CSP-D1差熱分析表Table 2 The differential thermal date of CSP-D1

表3 CSP-D1熱重分析表Table 3 The initial decomposition temperature and weight loss of CSP-D1 and CSP-D1

2.3 鎖陽多糖CSP-D1糖醛酸含量的確定

按照1.3.5方法，對(duì)樣品中糖醛酸含量進(jìn)行測(cè)定，得出CSP-D1中的糖醛酸含量為27.9%，與文獻(xiàn)中[7]報(bào)道的兩種鎖陽多糖的糖醛酸含量相比，平均高出了17.3%。

3 結(jié)論

1）鎖陽經(jīng)水提醇沉分離、脫蛋白脫色后，柱層析可以得到組分均一，分子量為5.5×104的CSP-D1多糖。2）鎖陽多糖CSP-D1是含糖醛酸（其糖醛酸種類目前還不確定）27.9%的酸性雜多糖，其單糖組成為：鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其中含量最多的糖為葡萄糖，其次為半乳糖。百分含量分別為44.26%和23.30%。紅外光譜證實(shí)其具有多糖類特征吸收峰，單糖連接方式中存在β連接，熱分析表明CSP-D1為無定形粉末。3）綜合以上結(jié)果，CSP-D1是鎖陽中提取得到的一種新的多糖，與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的鎖陽多糖相比，其單糖組成相對(duì)單一，并且具有較高的糖醛酸含量，該糖與已發(fā)現(xiàn)的鎖陽多糖不同的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的藥理優(yōu)勢(shì)還有待進(jìn)一步研究。

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