周先麗，梁成欽，徐慶，劉國雄，蘇小建，*

（1.廣西桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西 桂林 541004）

蛋白酶是目前工業(yè)用酶的主要酶制劑之一，占了工業(yè)用酶的60%市場(chǎng)份額[1]。蛋白酶在食品、化工、醫(yī)療、制藥等方面應(yīng)用廣泛[2]。植物是蛋白酶的重要來源，目前生產(chǎn)最多的植物蛋白酶是木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，其廣泛應(yīng)用于食品加工方面，如肉的嫩化等[3]。

羅漢果蛋白酶是本課題組從鮮羅漢果中發(fā)現(xiàn)一種新植物蛋白酶，其水解酪蛋白的活力達(dá)44.76×103kat/μg[4]。羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科（Cucurbitance）羅漢果屬植物的成熟果實(shí)，是廣西桂林地區(qū)的大宗經(jīng)濟(jì)作物[5]。羅漢果除了被廣泛用于醫(yī)藥外，還主要用于生產(chǎn)羅漢果甜苷。由于近年來羅漢果甜苷廣泛應(yīng)用于飲料和食品產(chǎn)品，從而使羅漢果行業(yè)得到了快速發(fā)展[6]。本課題組已經(jīng)初步研究和探討了羅漢果蛋白酶的提取分離工藝和部分理化性質(zhì)，如：酶起活性作用的最適條件和酶穩(wěn)定性的最佳條件等[4，7]。對(duì)大豆蛋白的水解條件也進(jìn)行了初步探討[8]。為了獲得更多的純羅漢果蛋白酶和測(cè)定其更多的性能參數(shù)，為開發(fā)利用該酶提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在本實(shí)驗(yàn)中，我們探索了新的分離純化方法，采用硫酸銨鹽析，CM Sepharose FF離子交換柱層析，Sepahcryl S-200 HR和Sepahcryl S-100 HR凝膠過濾柱層析等手段，對(duì)羅漢果蛋白酶進(jìn)行了分離純化，并對(duì)純化得到的羅漢果蛋白酶進(jìn)行了純度、分子量和等電點(diǎn)（pI值）測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

羅漢果：購于廣西桂林永福；三羥甲基氨基甲烷（Tris）：Augus公司產(chǎn)品；十二烷基磺酸鈉（SDS）：Biomol公司；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺：Promega；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-25、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14.4 ku～97.4 ku)、卵蛋白、等電聚焦標(biāo)準(zhǔn)蛋白、CM Sepharose FF、Sepahcryl S-200 HR、Sepahcryl S-100 HR：Amersham Pharmecia Biotech 公司產(chǎn)品；Shim-pack DIOL-300為天津市先明科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Symmetry C18柱為Waters公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

電泳儀（DYY-Ⅲ5）：北京六一儀器廠；冷凍干燥機(jī)（JDY-A）：吉林大學(xué)儀器技術(shù)發(fā)展公司；精密pH計(jì)（pHS-3C）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；蛋白分離基本系統(tǒng)（AKTA prime）：Amersham Pharmecia Biotech；高效液相色譜儀（Waters600）：雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)儀（2487）：Waters公司；UV2401紫外分光光度計(jì)：Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶的活性測(cè)定

羅漢果蛋白酶酶活力的測(cè)定方法見參考文獻(xiàn)[9]，以干酪素為底物。酶的活力單位定義：在規(guī)定條件下，1 min內(nèi)酶水解酪蛋白釋放出相當(dāng)于1μg/mL酪氨酸在275 nm波長(zhǎng)處的吸收度為1個(gè)活力單位。

1.2.2 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

采用Bradford檢測(cè)法,參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.2.3 羅漢果蛋白酶的分離純化

1.2.3.1 硫酸銨分級(jí)沉淀羅漢果蛋白酶的研究

將鮮羅漢果洗凈，粉碎，勻漿，冷凍離心（8000r/min，4℃）10 min，取上清液得羅漢果汁。取200 mL果汁用蒸餾水稀釋到700 mL，分成7等份，分別加入固體硫酸銨使其飽和度分別達(dá)到0%、20%、35%、50%、65%、80%、100%，靜置，然后冷凍離心（4℃，8000 r/min）15 min，分別取上清液，并以硫酸銨飽和度為0的果汁的蛋白質(zhì)濃度和酶活力為100%分別測(cè)定計(jì)算各上清液的蛋白質(zhì)相對(duì)濃度和相對(duì)酶活力。

1.2.3.2 羅漢果粗酶的制備

取適量羅漢果汁，以1.2.3.1確定的最佳硫酸銨到飽和度沉淀羅漢果蛋白酶，然后用適量的0.05 mmol/L Tris-HCl（pH 7）緩沖液（含1 mmol/L EDTA）溶解，再用上述緩沖液透析過夜至用1%的BaCl2溶液檢測(cè)不到沉淀，再冷凍干燥得羅漢果粗酶。

1.2.3.3 羅漢果蛋白酶的CM Sepharose FF柱層析

取4 g粗酶溶于15 mL 0.05 mmol/L HAc-NaAc（pH 4.3）緩沖溶液中，上樣于已用0.05 mmol/L HAc-NaAc（pH 4.3）緩沖溶液平衡的CM Sepharose FF陽離子交換柱（2.6 cm×70 cm），再用上述緩沖液洗脫，至洗脫液在280nm的紫外吸收低于0.02為止，再用0.05mmol/L～1 mmol/L HAc-NaAc（pH 4.3）緩沖溶液連續(xù)梯度洗脫，總洗脫體積為4300 mL，流速為1 mL/min，280 nm紫外吸光檢測(cè)，記錄，11 mL每管收集蛋白峰，0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 7）緩沖液（含1 mmol/L EDTA）透析過夜，再冷凍干燥，得羅漢果蛋白酶樣品。

1.2.3.4 羅漢果蛋白酶的Sepahcryl S-200 HR柱層析

將1.2.2.3所得蛋白酶樣品溶于5 mL 0.15 mol/L HAC-NH4AC緩沖液（pH 6.5），再上樣于已用上述緩沖溶液平衡的SepahcrylS-200HR凝膠柱（2.6cm×70cm)，用初始緩沖液以0.6 mL/min流速洗脫，280 nm紫外吸光檢測(cè)，記錄，6 m每管收集蛋白峰，0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 7）緩沖液（含1 mmol/L EDTA）透析過夜，所得酶液經(jīng)冷凍干燥，得羅漢果蛋白酶樣品。

1.2.3.5 羅漢果蛋白酶的Sepahcryl S-100 HR柱層析

將1.2.2.4得蛋白酶溶于1.5 mL0.15 mol/L HACNH4AC緩沖液（pH 6.5），再上樣于已用上述緩沖溶液平衡的Sepahcryl S-100 HR凝膠柱（1.6 cm×80 cm），用初始緩沖液以0.6 mL/min流速洗脫，280 nm紫外吸光檢測(cè)，記錄，每管5 mL收集蛋白峰，0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 7）緩沖液（含1 mmol/L EDTA）透析過夜，所得溶液經(jīng)冷凍干燥，得純化的羅漢果蛋白酶。

1.2.4 羅漢果蛋白酶的純度分析

將羅漢果蛋白酶配成濃度為10 mg/mL的溶液，采用凝膠HPLC和C18-HPLC分別進(jìn)行純度分析。凝膠HPLC條件為：Shim-pack DIOL-300柱，流動(dòng)相為50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0），流速為1 mL/min，280 nm紫外檢測(cè)，室溫，20μL進(jìn)樣；C18-HPLC條件為：Symmetry C18柱，流動(dòng)相為分別含20%乙腈和40%乙腈的0.1%三氟乙酸溶液階段梯度洗脫40 min，流速為1 mL/min，280 nm紫外檢測(cè)，室溫，20μL進(jìn)樣。

1.2.5 羅漢果蛋白酶的分子量測(cè)定

用SDS-PAGE和Sephacryl S-100 HR凝膠柱層析兩種方法測(cè)定羅漢果蛋白酶的分子量。SDS-PAGE測(cè)定條件[10]：12%的分離膠，5%的堆積膠，10 mA穩(wěn)流電泳30min，考馬斯亮藍(lán)染色15min，脫色過夜。Sephacryl S-100 HR凝膠柱層析測(cè)定方法：將1 mL 1 mg/mL純化的蛋白酶液和1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白液分別上樣于0.15mol/LHAC-NH4AC緩沖液（pH6.5）平衡的Sepahcryl S-100 HR 凝膠柱（1.6 cm×80 cm），并用此緩沖液以1 mL/min流速洗脫，280 nm紫外吸光檢測(cè)，記錄，收集蛋白質(zhì)峰，測(cè)量各峰的洗脫體積。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，洗脫液的紫外吸光度為縱坐標(biāo)分別作曲線圖。

1.2.6 羅漢果蛋白酶等電點(diǎn)的測(cè)定

用聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測(cè)定，凝膠濃度5%，交聯(lián)度3%，甘油10%。正極電泳液0.04mol/LDL-asparticacid，負(fù)極電泳液0.1mol/LNaOH，電壓1000 V，電流50 mA，電功率為30 W，預(yù)電泳30 min后去除加樣條再電泳約3.5 h至電流恒定，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸銨分級(jí)沉淀羅漢果蛋白酶的研究

用不同飽和度的（NH4）2SO4沉淀羅漢果蛋白酶，結(jié)果如圖1所示。

當(dāng)（NH4）2SO4飽和度為50%時(shí)，上清液蛋白酶活力僅保留6.3%，而蛋白保留率為52%，說明此硫酸銨濃度羅漢果蛋白酶大部被沉淀下來，因此本實(shí)驗(yàn)采用50%飽和度的（NH4）2SO4為制備羅漢果蛋白酶的鹽析條件。

2.2 羅漢果蛋白酶的分離純化

羅漢果汁經(jīng)硫酸銨鹽析、CM Sepharose FF柱層析（圖 2）、Sephacryl-200 HR 柱層析 （圖 3）、Sephacryl-100 HR柱層析（圖4）等操作后，結(jié)果如表2所示。得到的活性蛋白酶比活力達(dá)到9.4×107kat·g，回收率為4.2%，純化倍數(shù)為31.1倍，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示為一條蛋白酶帶（圖8）。

2.3 羅漢果蛋白酶的純度分析

表1 羅漢果蛋白酶的分離純化結(jié)果Table 1 Summary table of purification of protease

凝膠高效液相色譜在即定的條件下測(cè)得樣品為一單峰，保留時(shí)間為14.33 min，根據(jù)測(cè)得的峰面積采用歸一法可計(jì)算出酶純度為100%（圖5）；而C18反相高效液相色譜測(cè)得樣品在保留時(shí)間為44.58 min時(shí)出現(xiàn)一個(gè)尖銳的峰，根據(jù)測(cè)得的峰面積采用歸一法可計(jì)算出酶純度約為98.8%（圖6）。

2.4 羅漢果蛋白酶的分子量測(cè)定

用凝膠過濾測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積（圖7），制作對(duì)數(shù)線性圖，得出線性公式 y=-67693ln（x）＋365507，將純化酶的洗脫體積122 mL代入公式，得該酶分子量為40.3 ku；用SDS-PAGE測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率（圖8），制作對(duì)數(shù)線性圖，得線性公式為y=-49275ln（x）－2543.7，將純化酶的遷移率0.43代入公式得分子量為39.0 ku，與前者的分子量基本一致，可初步確定該酶分子量可能處于39.0 ku～40.3 ku之間。

2.5 羅漢果蛋白酶等電點(diǎn)的測(cè)定

等電點(diǎn)與分子量一樣，也是蛋白質(zhì)重要的的理化參數(shù)之一，一般利用等電聚焦電泳來測(cè)定。羅漢果蛋白酶純化產(chǎn)物的等電聚焦結(jié)果如圖9所示。

圖9 羅漢果蛋白酶的等電聚焦圖譜Fig.9 Isoelectric point determination of protease by IEF-PAGE

從等電聚焦結(jié)果可以看出，該蛋白酶的等電點(diǎn)較高，大約為pH 8.55。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過一系列的分離純化操作步驟后得到的羅漢果蛋白酶比活力達(dá)94.0kat/g，活性回收率為4.2%，提純倍數(shù)為31.1倍，與文獻(xiàn)[4]相比，純化的酶活力提高了1倍左右，而回收率相差不大，但純化倍數(shù)提高了約16倍。純化的羅漢果蛋白酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報(bào)道的純化得到的植物蛋白酶（木瓜蛋白酶[11]6.2 kat/g，生姜蛋白酶[12]0.0035 kat/g，菠蘿蛋白酶[13]0.94 kat/g，無花果蛋白酶[14]0.015 kat/g），這進(jìn)一步說明了羅漢果蛋白酶的高活性。

根據(jù)SDS-PAGE和凝膠色譜對(duì)蛋白酶分子量的測(cè)定，推測(cè)該酶可能并不含有二硫鍵，因此該酶可能只有一個(gè)亞基，并由單鏈組成。羅漢果的等電點(diǎn)為pH 8.55，可能是文獻(xiàn)[4]所報(bào)道的為何羅漢果蛋白酶有兩個(gè)最適的起酶活作用的pH，也有兩個(gè)最適的酶穩(wěn)定的pH的原因，因?yàn)榈入婞c(diǎn)剛好處于它們之間，當(dāng)pH接近等電點(diǎn)時(shí)，酶出現(xiàn)失活。

綜合羅漢果蛋白酶的理化性質(zhì)表明，羅漢果蛋白酶水解活性高，結(jié)構(gòu)特別，穩(wěn)定性好，且由于羅漢果果實(shí)廣泛用于食品和醫(yī)療工業(yè)，其安全性也得到了驗(yàn)證。另外，羅漢果已形成了一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，因此羅漢果蛋白酶具有很大的開發(fā)利用價(jià)值。

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