張怡堃，王華，楊萍，李澤良，楊月峰，陳協(xié)群，王立生

自miRNA 被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已日益成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。盡管已經(jīng)取得了大量令人欣喜的成果，但在miRNA的生物發(fā)生、功能行為等眾多環(huán)節(jié)上仍有很多未解之謎[1-2]；這一方面要求我們謹(jǐn)慎地看待和應(yīng)用已有的研究成果，另一方面要加快完善 miRNA 相關(guān)的基礎(chǔ)分子生物學(xué)機(jī)制的研究，尋找和開(kāi)發(fā)更多適用于miRNA 研究的新技術(shù)，為全面理解 miRNA的生物學(xué)意義奠定更為牢固的基礎(chǔ)。

miR29c是我們通過(guò) miRNA 微陣列生物芯片篩選獲得的在骨髓瘤細(xì)胞中高表達(dá)的miRNA，但是對(duì)于其在骨髓瘤中的功能研究鮮有報(bào)道。為更好研究其功能，我們構(gòu)建了攜帶 miR29c的重組腺病毒，并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞和重組腺病毒 質(zhì)粒：穿梭質(zhì)粒 pShuttle-cmv、腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1購(gòu)自美國(guó) Strategene公司；pcDNA3.0-miR29c 質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院鄭曉飛教授惠贈(zèng)。

菌種：大腸桿菌 BJ5183 購(gòu)自美國(guó) Strategene公司、DH5a 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)責(zé)任有限公司。

細(xì)胞：人骨髓瘤細(xì)胞系 SKO-007和U266（含10% 元亨血清的1640 培養(yǎng)基）、人骨髓瘤細(xì)胞系XG7 含 10% 元亨血清，3 ng/ml IL-6的1640 培養(yǎng)基）；HEK293 細(xì)胞（Ad5 E1 區(qū)轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞）為本室保存。

重組腺病毒：重組腺病毒 Ad5F11p-EGFP、Ad5F11p 為本室構(gòu)建制備。

1.1.2 主要試劑 動(dòng)物基因組抽提試劑盒MagExtractor-Genome、高保真 DNA 聚合酶 KOD-plus 購(gòu)自日本 Toyobo公司；離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒，脂質(zhì)體 2000、D2000 marker 購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶 PacI、PmeI 購(gòu)自美國(guó) Biolab公司；KpnI、EcoRV、HindIII、XbaI、小牛腸來(lái)源的堿性磷酸酶（CIAP）、λ/HindIII Marker 購(gòu)自日本TaKaRa公司；RPMI 1640、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；FBS 購(gòu)自美國(guó) Hyclone公司和北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；其他試劑：胰酶、PBS 按分子克隆配制；瓊脂糖購(gòu)自西班牙 Biowest Agarose Regular公司。

1.1.3 主要儀器 Mastercycler PCR 儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；倒置熒光顯微鏡和普通顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus公司；CCL-18 數(shù)碼成像系統(tǒng)購(gòu)自日本 Nikon公司；紫外凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)UVP公司；水平電泳系統(tǒng)購(gòu)自北京六一儀器廠；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器廠；DU640 型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó) Beckman公司；2300 型 CO2氣體培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Thermo公司；高速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自美國(guó) Heraeus公司。

1.2 方法

1.2.1 攜帶 miR29c 基因腺病毒載體的構(gòu)建 以pcDNA3.0-miR29c 為模板設(shè)計(jì)引物，于兩端分別連接酶切位點(diǎn) KpnI和EcoRV，PCR 擴(kuò)增獲取miR29c 基因。引物：上游：5' gggggTACCgAggATgC CCTggAgTATTC 3'；下游：5' ggggATATCCATgATC TTCCTTCCCTATTC 3'；擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 25 s，50 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，6個(gè)循環(huán)；94 ℃25 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，25個(gè)循環(huán)；68 ℃ 4 min。穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV 與miR29c 基因分別進(jìn)行 KpnI和EcoRV 雙酶切后，T4 DNA 連接酶于16 ℃ 連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，Kana+LB 平板篩選 pShuttle-CMV-miR29c。pShuttle-CMV-miR29c 酶切鑒定正確后送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序鑒定正確的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-miR29c 經(jīng) PmeI 酶切后線性化，CIAP 去磷酸化并割膠純化。純化產(chǎn)物以 200 ?，2.5 kV，25 μF的條件，電擊轉(zhuǎn)化含有 Ad5F11p 骨架質(zhì)粒的BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞。Kana+篩選pAd5F11p-miR29c，PacI 酶切鑒定重組質(zhì)粒。

1.2.2 重組腺病毒 Ad5F11p-miR29c的制備及鑒定 重組腺病毒質(zhì)粒 pAd5F11p-miR29c 經(jīng) PacI酶切后，酚氯仿抽提純化，紫外分光光度法測(cè)定線性化質(zhì)粒的濃度及純度。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將其轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞 HEK293，10～12 d 觀察噬斑形成和細(xì)胞病變并收集病毒液。

病毒基因組DNA 提?。簩⒉《疽焊腥?HEK293細(xì)胞后，收集病變細(xì)胞，重懸于400 μl PBS 中；–70 ℃和37 ℃ 反復(fù)凍融 3 次后，12000 r/m 離心 5 min，收集上清；分別加入 21 μl 10 mg/ml的蛋白酶 K、21 μl 10% SDS 以及9 μl 0.5 mol/L EDTA，于37 ℃ 放置過(guò)夜；酚氯仿抽提獲取病毒基因組DNA。以病毒基因組DNA 為模板，PCR鑒定目的基因 miR29c的表達(dá)。

1.2.3 重組腺病毒 Ad5F11p-miR29c 及對(duì)照病毒 Ad5F11p-EGFP的擴(kuò)增及滴度測(cè)定 將鑒定正確的Ad5F11p-miR29c 病毒液以及本室保存的Ad5F11p-EGFP 病毒液感染 HEK293 細(xì)胞，獲取大量病變細(xì)胞，重懸于少量培養(yǎng)上清中；于–70 ℃和37 ℃ 反復(fù)凍融 3 次，于4 ℃，3000 r/m 離心30 min，收集病毒上清。經(jīng)氯化銫密度梯度離心收集病毒帶，過(guò)夜透析后將純化的病毒液分裝，–70 ℃保存。經(jīng)快速 CPE 法和有限稀釋法[5]分別檢測(cè)病毒滴度。

1.2.4 重組腺病毒 Ad5F11p-EGFP 對(duì)骨髓瘤細(xì)胞感染效率檢測(cè) 重組腺病毒 Ad5F11p-EGFP 分別以 50、100、150、200和250 MOI 分別感染人骨髓瘤細(xì)胞系 SKO-007、U266和XG7。熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞感染效率。

1.2.5 miR29c 對(duì)骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響 選擇最佳感染復(fù)數(shù)，以 Ad5F11p-miR29c 感染骨髓瘤細(xì)胞，Annexin-V/PI 雙標(biāo)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建攜帶 miR29c 基因的腺病毒載體pAd5F11p-miR29c

以 pcDNA3.0-miR29c 質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，成功獲得 miR29c 基因（圖 1A）。將 miR29c基因插入到穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV，篩選得到pShuttle-CMV-miR29c。酶切鑒定結(jié)果顯示，KpnI和EcoRV 雙酶切出現(xiàn) 250 bp 左右條帶，與預(yù)期相符；PCR 擴(kuò)增目的基因 miR29c，結(jié)果如圖 1B 所示，證實(shí)質(zhì)粒正確。最終經(jīng)北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序正確。表明已成功構(gòu)建攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV-miR29c。

經(jīng)去磷酸化處理的線性化穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV-miR29c，電擊轉(zhuǎn)化含 Ad5F11p 骨架質(zhì)粒的BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞，Kana+篩選陽(yáng)性克隆。PacI 酶切出現(xiàn) 2 條條帶，與Ad5F11p-EGFP 質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物一致，表明已成功獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd5F11p-miR29c（圖 1C）。

圖1 pAd5F11p-miR29c 構(gòu)建及鑒定Figure1 Construction and identification of pAd5F11pmiR29c

2.2 成功制備重組腺病毒 Ad5F11p-miR29c 并鑒定正確

圖2 HEK293 細(xì)胞噬斑產(chǎn)生及完全病變（A：細(xì)胞噬斑；B：完全病變）Figure2 HEK293 cells with plaque forming and completely cytopathy (A: Plaque forming cells; B: Cells with completely cytopathy)

重組腺病毒質(zhì)粒 pAd5F11p-miR29c 經(jīng) PacI線性化和酚氯仿抽提后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD260/OD280比值為1.892，質(zhì)粒濃度為655μg/ml，均符合轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染細(xì)胞融合度達(dá)到 80% 以上的HEK293 細(xì)胞，9 d 出現(xiàn)噬斑，12 d 出現(xiàn)細(xì)胞完全病變（CPE）（圖 2）。

提取病毒基因組DNA，采用 miR29c 基因的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小為250 bp 左右，與目的條帶一致（圖3）。表明已經(jīng)成功制備重組腺病毒 Ad5F11pmiR29c。

圖3 PCR 鑒定病毒基因組中 miR29c 表達(dá)電泳結(jié)果Figure3 Identification of recombinant adenoviral vectors carrying miR29c with PCR method

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) Ad5F11p-EGFP 感染 48 h 后各細(xì)胞系 EGFP 表達(dá)Table1 EGFP expression after infection with Ad5F11p-EGFP in hemapoietic cell lines

2.3 重組腺病毒 Ad5F11p-EGFP 對(duì)骨髓瘤細(xì)胞感染效率的檢測(cè)

快速 CPE和有限稀釋法檢測(cè)重組腺病毒Ad5F11p-miR29c和Ad5F11p-EGFP的感染滴度，分別為1.56×1010和1.0×109。Ad5F11p-EGFP分別以 50、100、150、200、250 MOI 感染人骨髓瘤細(xì)胞系 SKO-007、U266、XG7和K562。感染后48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)綠色熒光蛋白 EGFP的表達(dá)，結(jié)果如表1 所示。

2.4 重組腺病毒 Ad5F11p-miR29c 可以介導(dǎo)miR29c 在骨髓瘤細(xì)胞中高表達(dá)

Ad5F11p-miR29c 以 150 MOI 感染 SKO-007和U266 細(xì)胞，以 100 MOI 感染 XG7 細(xì)胞。感染后48 h，qRT-PCR 檢測(cè) miR29c的表達(dá)（圖 4）。結(jié)果表明，Ad5F11p-miR29c 感染后48 h，骨髓瘤細(xì)胞 SKO-007、U266和XG7 細(xì)胞中 miR29c的表達(dá)率明顯高于感染前。表明 Ad5F11p-miR29c能夠在造血細(xì)胞中有效表達(dá)。

圖4 Real-time PCR 檢測(cè)重組腺病毒 Ad5f11p-miR29c感染骨髓瘤細(xì)胞系 48h 后，miR29c 表達(dá)量的變化Figure4 Determination of miR29c levels in SKO-007，U266 and XG-7 cells 48 h after infection with Ad5F11p-miR29c by qRT PCR

2.5 過(guò)表達(dá) miR29c 誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡

用腺病毒 Ad5F11p-miR29c 以優(yōu)化后的感染復(fù)數(shù) 150 MOI 感染 SKO-007 細(xì)胞，100 MOI 感染 XG7 細(xì)胞，同時(shí)以未感染及以 Ad5F11p-null空病毒感染的細(xì)胞為對(duì)照，于感染后12、24、48 h，Annexin-V/PI 雙標(biāo)后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖 5、圖 6 所示，Ad5F11p- miR29c 感染后48 h，骨髓瘤細(xì)胞 SKO-007和XG7 細(xì)胞的凋亡率明顯高于感染前（未感染病毒的細(xì)胞凋亡率分別為SKO-0078.99%，XG75.62%；感染空病毒的細(xì)胞凋亡率分別為SKO-00711.2%，XG713.44%，而感染 Ad5F11p-miR29c 病毒的細(xì)胞凋亡率分別達(dá)到 SK0-00726.5%，XG746.9%）。表明過(guò)表達(dá) miR29c 可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。

圖5 Ad5F11p-miR29c 病毒感染 SKO-007（A）和XG7（B）細(xì)胞 12、24、48 h 后的流式檢測(cè) Annexin V/PI 表達(dá)，同時(shí)以未感染病毒的細(xì)胞和用空病毒感染的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照，為三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，采用 t 檢驗(yàn)分析Figure5 Annexin V/PI assay in SKO-007 (A) and XG7 (B)cells after 12, 24 and 48 h infection with adenovirus miR-29c or controls (without infection or empty vector).The results are shown as percentage of apoptotic cells.Data are the average of three independent experiments±SD.P-values were obtained using t tests.

圖6 miR29c 誘導(dǎo) SKO-007 細(xì)胞凋亡的代表性的流式圖Figure6 Flow cytometric analysis of apoptosis with Annexin V/PI staining in SKO-007cells

3 討論

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的約 22個(gè)核苷酸左右的單鏈小 RNA，具有高度的種間保守性和時(shí)空特異性。通過(guò)作用于靶基因的3′UTR（3′ 非翻譯區(qū)）在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，廣泛地參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、分泌和凋亡等生命活動(dòng)[6]。miRNA的這些特點(diǎn)，為生物治療開(kāi)拓了新的視野。通過(guò)基因療法手段控制miRNA 水平從而治療疾病就成為治療學(xué)進(jìn)展中極具吸引力的一項(xiàng)新方法。

眾所周知，miRNA 參與人類(lèi)多種疾病的形成過(guò)程，這就為疾病治療提供了新的潛在靶標(biāo)。一直以來(lái)人們都在嘗試研究如何在體內(nèi)特異地調(diào)節(jié)miRNA的水平。這么多年來(lái)在反義RNA、核酶以及一些基因治療方法上取得的研究成果為體內(nèi)研究 miRNA 提供了一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)和研究思路，但均各自存在缺陷和不足[7-9]。目前，利用miRNA 為基礎(chǔ)的生物治療的主要障礙就是如何有效地將 miRNA 或反義寡核苷酸 anti-miRNA 在體內(nèi)導(dǎo)入靶細(xì)胞。因此，尋找有效的基因轉(zhuǎn)移載體成為眾多科研人員的研究重點(diǎn)。

理想的基因轉(zhuǎn)移載體不僅應(yīng)具有將目的基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的功能，還應(yīng)該保證目的基因按時(shí)按量表達(dá)。重組腺病毒構(gòu)建載體是目前應(yīng)用最多的一種高效基因轉(zhuǎn)移載體[2-3]，宿主細(xì)胞范圍廣、插入外源基因穩(wěn)定、目的基因表達(dá)水平高、包裝容量大及不整合等優(yōu)點(diǎn)；腺病毒載體構(gòu)建、制備簡(jiǎn)單，容易制備高滴度病毒顆粒。我們前期已經(jīng)利用纖維頂球替代改構(gòu)方法構(gòu)建了具有造血細(xì)胞靶向性的腺病毒載體系統(tǒng) Ad5F11p，該系統(tǒng)方便構(gòu)建帶有不同功能基因的靶向腺病毒載體，大大地提高對(duì)造血細(xì)胞的感染效率，因而 Ad5F11p 為造血調(diào)控的基礎(chǔ)研究以及血液腫瘤的基因治療奠定基礎(chǔ)，是非常有用的腺病毒載體[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)選用血液細(xì)胞靶向性腺病毒 Ad5F11p作為載體，首先通過(guò) PCR 方法獲得目的基因并在其兩端分別連接上酶切位點(diǎn)，隨后將目的基因miR29c 插入穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，通過(guò)酶切、PCR 擴(kuò)增及測(cè)序三重鑒定，證實(shí)目的基因 miR29c已正確插入穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV 中。與含腺病毒 Ad5F11p 基因組的質(zhì)粒 pAd5F11p 共轉(zhuǎn)染至BJ5183 細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，重組后轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞制備病毒，有重組病毒生成后形成的空斑大多為含有目的基因的陽(yáng)性克隆。本實(shí)驗(yàn)中，感染性試驗(yàn)證明了腺病毒載體具有良好的感染活性。采用插入的miR29c 基因特異引物和腺病毒載體特異引物進(jìn)行 PCR 鑒定，證明包裝的腺病毒基因組攜帶miR29c。利用帶有 GFP 對(duì)照基因的腺病毒載體Ad5F11p-GFP，初步檢測(cè)了其對(duì) 3 種骨髓瘤細(xì)胞系的感染效率，感染滴度在100～150 MOI 范圍內(nèi)，感染效率均在90% 以上，體現(xiàn)了很好的造血細(xì)胞靶向性。用重組腺病毒感染 SKO-007等細(xì)胞后，通過(guò) real-time PCR 證實(shí)腺病毒載體可以提高miR29c 在骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)。利用腺病毒載體在骨髓瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá) miR29c，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR29c 可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。本研究通過(guò)構(gòu)建并制備攜帶 miR29c 目的基因的腺病毒，初步觀察了其對(duì)造血細(xì)胞的感染及對(duì)骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步 miRNA 功能研究及基于miRNA的基因治療研究打下了基礎(chǔ)。

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