陳青，陳曉，孫俊，曾容，胡素泉，李岷，劉維達(dá)

香菇多糖（lentinan，LNT）作為免疫調(diào)節(jié)劑已在我國、日本、美國及東南亞各國等臨床上用于腫瘤治療，該多糖是菌體細(xì)胞壁中分離的主鏈為1→3 連接鍵型、枝鏈為 1→6 鍵型的 β-D-葡聚糖[1-3]。國外學(xué)者及我們的研究均表明樹突狀細(xì)胞相關(guān) C 型凝集素 1（Dectin-1）是識別 β-葡聚糖、激活免疫反應(yīng)的最主要模式識別受體[4-6]。本研究旨在研究香菇多糖能否依賴人單核/巨噬細(xì)胞系THP-1 細(xì)胞表達(dá)的 Dectin-1 介導(dǎo)來誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及主要試劑 香菇多糖購自南京康海藥業(yè)有限公司；人 THP-1 細(xì)胞株購自美國模式菌種收藏中心（ATCC）；IL-12 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自美國 R&D Systems 公司；SuperScript III 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒為美國 Invitrogen 公司產(chǎn)品；Dectin-1抑制劑昆布多糖（laminarin）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 Smart Cycler System II 型實時熒光定量 PCR 儀為美國 Cepheid 公司產(chǎn)品；Bio-rad 680 型全自動酶標(biāo)儀為美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人 THP-1 單核細(xì)胞在含 10%小牛血清、1% 青鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)、傳代。接種 2 × 106個細(xì)胞于 6 孔培養(yǎng)板，血清饑餓 16 h 后，與刺激物共培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光 RT-PCR THP-1 細(xì)胞與 LNT（終濃度 5 μg/ml）共培養(yǎng)，并設(shè)培養(yǎng)基空白對照組。Trizol 法抽提總 RNA，取 2 μg 總 RNA 按SuperScript III 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書合成cDNA。采用 Syber green 法對目的基因進行擴增，相關(guān)基因引物如下[5]：

Dectin-1：正向序列 5′ TCAATGTAAGAGGAA GGGTG 3′；反義序列 5′ GCCAAGCTCTCTAAAC ATTT 3′。

IL-12p40：正向序列 5′ CCACATTCCTACTTC TC 3′；反義序列 5′ GTCTATTCCGTTGTGTC 3′。

IL-12p35：正向序列 5′ ACCAGGTGGAGTTC AAGACC 3′；反義序列 5′ TGGCACAGTCTCACT GTTGA 3′。

GAPDH：正向序列 5′ CGGATTTGGTCGTATT GGG 3′；反義序列 5′ CTCGCTCCTGGAAGATGG 3′。

以 2?ΔΔCT法計算目的基因的變化水平，ΔCT=目的基因 CT值 － 內(nèi)參照（GAPDH）CT值；某一樣品的 ΔΔCT= 某一樣品 ΔCT－ 最低表達(dá)的樣品的 ΔCT。LNT 刺激后 1、6、24 h 分別檢測Dectin-1 的 mRNA 水平；刺激后 1、4、6 h 分別檢測 IL-12p35、IL-12p40 的 mRNA 水平。

1.2.3 ELISA 法測定 IL-12 含量 THP-1 細(xì)胞與終濃度分別為 10、5、1 μg/ml 的 LNT 共培養(yǎng) 6 h 后；收集上清液，按照試劑盒說明書檢測上清液中 IL-12 的含量。用 laminarin 100、50 μg/ml 分別預(yù)處理 THP-1 細(xì)胞 30 min，再予 5 μg/ml 的LNT 刺激；檢測上清液中 IL-12 的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LNT 對 Dectin-1 的 mRNA 表達(dá)水平的影響

LNT 作用 THP-1 細(xì)胞后 1、6、24 h，LNT組、培養(yǎng)基對照組的 Dectin-1 的 mRNA 水平結(jié)果見圖 1。上述 3 個不同時刻，LNT組的 Dectin-1 的mRNA 水平均明顯高于對照組（*P ＜ 0.001）。

圖1 LNT 對 Dectin-1 的 mRNA 表達(dá)水平的影響Figure 1 The effect of LNT on the level of Dectin-1 mRNA

圖2 LNT 對 IL-12p35 mRNA 水平的影響Figure 2 The effect of LNT on the level of IL-12p35 mRNA

2.2 LNT 對 IL-12p35、IL-12p40 mRNA 表達(dá)水平的影響

LNT 作用 THP-1 細(xì)胞 1、4、6 h 后，IL-12p35、IL-12p40 的 mRNA 表達(dá)水平的變化情況見圖 2 和圖 3。與培養(yǎng)基對照組比較，LNT組IL-12p35、IL-12p40 的 mRNA 水平在刺激不同時間后均顯著增高（*P ＜ 0.0001）。

圖3 LNT 對 IL-12p40 mRNA 水平的影響Figure 3 The effect of LNT on the level of IL-12p40 mRNA

2.3 LNT 對 IL-12 蛋白分泌的影響

不同濃度組（1、5、10 μg/ml）的 LNT 作用THP-1 細(xì)胞 6 h，上清液中 IL-12 蛋白含量結(jié)果見圖 4。三組含量均明顯高于培養(yǎng)基對照組（*P ＜0.0001）。

圖4 LNT 對 IL-12 蛋白分泌的影響Figure 4 The effect of LNT on the secretion of IL-12 protein

2.4 Dectin-1 抑制劑 laminarin 對 LTN 誘導(dǎo)IL-12 分泌的影響

不同濃度 laminarin（100、50 μg/ml）預(yù)處理THP-1 細(xì)胞后，再予 5 μg/ml LNT 刺激，檢測上清液中 IL-12 的含量，結(jié)果見圖 5。與 LNT組比較，laminarin 預(yù)處理組 IL-12 分泌量分別降低了 51% 和26%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（**P ＜ 0.0001和*P ＜ 0.01）。

圖5 Dectin-1 抑制劑 laminarin 對 LTN 誘導(dǎo) IL-12 分泌的影響Figure 5 The effect of dectin-1 inhibitor laminarin on the secretion of IL-12 induced by LNT

3 討論

香菇多糖已被證實具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，能激活巨噬細(xì)胞、LAK 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞[1]。有研究發(fā)現(xiàn)可通過誘導(dǎo)消化道腫瘤患者上調(diào) Th1 型細(xì)胞因子分泌（如 IL-2、IL-12）并抑制 Th2 型細(xì)胞因子分泌（如 IL-4）來影響獲得性免疫反應(yīng)[3]。而對于免疫細(xì)胞是如何識別 LNT 而誘發(fā)相應(yīng)免疫反應(yīng)的相關(guān)機制尚未充分揭示。近來發(fā)現(xiàn) Dectin-1 作為一種 C 型凝集素樣受體家族的成員，是識別 β-1,3 和（或）β-1,6 葡聚糖的高親和性關(guān)鍵受體，分布于樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、某些亞類的 T 淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及上皮、角膜和皮膚等組織[4-6]。本研究旨在初步明確人單核細(xì)胞系 THP-1 細(xì)胞能否通過所表達(dá)的 Dectin-1 來識別香菇多糖并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn) THP-1 細(xì)胞上 Dectin-1 的 mRNA表達(dá)水平在 LNT 作用后出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，與無刺激細(xì)胞對照組比較，在作用 1 h 后，該受體 mRNA水平出現(xiàn)升高，6 h 達(dá)到峰值，在作用 24 h 后仍可出現(xiàn)較高水平的表達(dá)，結(jié)果提示 LNT 在一定范圍內(nèi)能以時間-效應(yīng)方式上調(diào) THP-1 細(xì)胞Dectin-1 的 mRNA 表達(dá)。

IL-12 是由 p40 和p35 兩個亞基構(gòu)成的異源二聚體，分子量約為（70～75）× 103，編碼 p35 和p40 的基因位于不同的染色體，轉(zhuǎn)錄由各自的啟動子和增強子調(diào)控，具有免疫活性的 IL-12p70 需要兩亞基共同表達(dá)后聚合而成，主要由單核巨噬細(xì)胞、DC 細(xì)胞等分泌[7]。Murata 等[8]報道 LNT 能誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌 IL-12 蛋白，李丹等[9]采用 ELISA 法檢測 LNT 體外與人 PBMC 細(xì)胞作用后 IL-12 水平顯著增加。本研究與上述研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn) LNT 刺激 THP-1 單核細(xì)胞后，能顯著促進 IL-12 的分泌，且隨 LNT 濃度增高而升高，呈現(xiàn)劑量依賴方式。LNT 還能上調(diào) IL-12p35和p40 兩個亞基的 mRNA 表達(dá)，并呈現(xiàn)時間-效應(yīng)關(guān)系。

THP-1 細(xì)胞預(yù)先與不同濃度的 Dectin-1 抑制劑 laminarin 共孵育后，再應(yīng)用 LNT 刺激，發(fā)現(xiàn)與 laminarin 未預(yù)處理組比較，分泌 IL-12 的含量明顯降低，且與 laminarin 的濃度相關(guān)，當(dāng)濃度升高，釋放 IL-12 的含量則隨之降低。這進一步表明LNT 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞分泌釋放 IL-12 的能力是與 Dectin-1 對其識別和結(jié)合有關(guān)。

IL-12 能促進 CD4+ 細(xì)胞向 Th1 型漂移而增強免疫反應(yīng)，Th1 細(xì)胞進而誘導(dǎo) CTL、NK 和巨噬細(xì)胞的增生和活化，共同參與腫瘤抑制反應(yīng)[10]。本研究結(jié)果初步表明人單核巨噬細(xì)胞系 THP-1 細(xì)胞能依賴所表達(dá)的 Dectin-1 識別香菇多糖而誘導(dǎo)分泌 IL-12。這為進一步揭示香菇多糖參與機體抗腫瘤免疫反應(yīng)的機制提供理論依據(jù)。在今后研究中，還要對 Dectin-1 相關(guān)的下游信號傳導(dǎo)通路，包括脾臟酪氨酸激酶（Syk）-蛋白酶募集域 9（CARD9）信號通路及絲氨酸-蘇氨酸激酶-1（Raf-1）信號通路[11]在此效應(yīng)中的作用進行深入探討。

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