高 玲，張 丹，高 峰，郭 棟，楊瑞章，于伯華

(1.鹽城出入境檢驗檢疫局檢測中心，江蘇鹽城 224002;2.江蘇出入境檢驗檢疫局，南京 200001)

我國在水產(chǎn)品出口中曾多次發(fā)生因抗生素以及激素等藥物殘留超標(biāo)而導(dǎo)致的經(jīng)濟損失［1－2］。氨基糖苷類(Aminoglycosides，AGs)抗生素是一類分子結(jié)構(gòu)中含有一個氨基環(huán)己醇和一個或多個氨基糖分子、以糖苷鍵相連物質(zhì)的總稱，用作獸藥的主要有鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、新霉素和卡那霉素等幾種［3－4］。此類抗生素的抗菌作用強，主要作用于革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯氏菌、產(chǎn)氣桿菌等，屬水產(chǎn)品中常用的抗生素。耳毒性和腎臟毒性是AGs共有的毒副作用。AGs能選擇性地損害第8對腦神經(jīng)，導(dǎo)致前庭和耳蝸神經(jīng)損傷，前者多見于鏈霉素、卡那霉素和慶大霉素，后者多見于卡那霉素等。由于其毒副作用并易產(chǎn)生耐藥性，鏈霉素族已被停用［5］。

韓國和日本對我國出口水產(chǎn)品中的氨基糖苷類藥物殘留要求控制在200 μg/kg以內(nèi)。近年來，我國也加強了對動物源食品中該類藥物的殘留監(jiān)控。但由于這類藥物具有較高的水溶性和質(zhì)子化傾向，易與組織成分結(jié)合或被玻璃器皿吸附，樣品處理的回收率低;異構(gòu)體較多，色譜分離過程復(fù)雜，分離條件不易控制等因素，目前對于氨基糖苷類抗生素殘留的測定方法研究較少。對氨基糖苷類藥物的檢測很多采用液相色譜－熒光或紫外檢測［6－8］，由于該類化合物結(jié)構(gòu)中缺少發(fā)色團和熒光團，需進行柱前衍生化，操作較為繁瑣，穩(wěn)定性不高。氨基糖苷類抗生素水溶性好、極性大、分子量高，特別適合于液相色譜分析，因此，近年來液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC－MS)技術(shù)成為測定該類化合物的有力手段［9－10］，但針對水產(chǎn)品基質(zhì)的研究較少。

本文主要研究了采用HPLC－MS測定魚、淡水小龍蝦等水產(chǎn)品中氨基糖苷類抗生素殘留的檢測方法。方法快速、簡便、靈敏度高，可以滿足目前進出口及國家殘留監(jiān)控的要求。

1 實驗材料

1.1 儀器 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀:Finnigan TSQ Quantum Ultra(配備HESI源);Surveyor液相色譜系統(tǒng):液相系統(tǒng)包括自動進樣器(Autosampler 1.4)，質(zhì)譜泵(MS Pump 2.0)。渦旋混勻器(KW－80A上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);分析天平感量為0.01 mg。

1.2 試劑 甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck)，甲酸(色譜純，F(xiàn)luka)，1－庚烷磺酸鈉(色譜純，東京化成工業(yè)株式會社)，七氟正丁酸(色譜純)，水為重蒸蒸餾水。

1.3 藥品 鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素購自Sigma－Aldrich公司，純度≥98%。

1.4 溶液 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇－水(30∶70)溶解定容，配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放置于0～4℃冰箱中保存(保存期12個月)。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取一定量的1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用0.5%七氟正丁酸－0.001 mol/L庚磺酸鈉溶液(1∶1)稀釋到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度，溶液濃度為 10、20、50、100、200、500 ng/mL，放置于冰箱中冷凍保存(保存期1個月)。提取液:取5.05 g庚烷磺酸鈉、2.05 g磷酸鈉、2.5 mL 磷酸，用500 mL超純水溶解。

1.5 樣品 水產(chǎn)品樣品為各地送檢樣。

2 實驗方法

2.1 HPLC條件 Hypersil Gold C18色譜柱 (100 mm ×2.1 mm，5 μm);流動相:A 相為乙腈，B 相為0.3%乙酸水溶液，流速0.25 mL/min，梯度洗脫程序見表1，柱溫為室溫;進樣體積20 μL;分析時間為10 min。

表1 氨基糖苷類藥物色譜分離的線性梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜條件 離子化方式:ESI，正離子檢測;監(jiān)測方式:MRM;鞘氣:40，輔助氣:5;電離電壓:4000 V;離子化溫度:350℃。主要質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 主要質(zhì)譜參數(shù)

2.3 外標(biāo)法定量 定量依據(jù)為外標(biāo)法定量，定量離子采用豐度最大的二級碎片。

式中:X－試樣中藥物含量，μg/Kg;A－樣品峰面積;V－定容體積，mL;As－標(biāo)準(zhǔn)品峰面積;m－樣品質(zhì)量，g;C－標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μg/mL。

2.4 樣品提取 稱取5.00 g樣品，準(zhǔn)確加入15 mL提取液和3 mL 5%三氯乙酸－EDTA溶液，混勻1 min，超聲15 min，于8500 r/min下高速離心5 min，取上清液用氨水調(diào)pH至3～4;濾液過HLB小柱(柱子用3 mL甲醇、5 mL超純水預(yù)洗)，流速控制在1 d/s左右，用3 mL超純水淋洗;用5 mL甲醇洗脫，收集于10 mL刻度離心管中，洗脫液于45℃氮氣吹干，用0.5%七氟正丁酸－0.001 mol/L庚磺酸鈉(1∶1)溶液溶解殘渣，過水系0.45 μm的膜，待進樣檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗條件的選擇 要想使氨基糖苷類抗生素從水產(chǎn)品組織中游離出來，需要較高或較低的pH條件，通過比較，我們選擇使用磷酸鹽緩沖溶液，5種氨基糖苷藥物均能獲得較好的回收率。氨基糖苷類抗生素的檢測需加入離子對試劑，同時，要求加入離子對試劑的濃度不能對質(zhì)譜有顯著影響，因此我們選擇0.5%七氟正丁酸－0.001 mol/L庚磺酸鈉溶液為定溶液。大多對氨基糖苷類藥物檢測的文獻中會在流動相中也加入七氟正丁酸或三氯乙酸［11－12］，我們嘗試用乙酸代替，發(fā)現(xiàn)同樣可以獲得較好的檢測限，與加入七氟正丁酸或三氯乙酸沒有明顯差異，考慮乙酸對質(zhì)譜的影響更小，因此在流動相中加入乙酸。比較了0.2%、0.3%和0.4%三個乙酸濃度，發(fā)現(xiàn)流動相中加入0.3%的乙酸時峰形最好，因此最終在流動相中加入0.3%的乙酸。

3.2 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限 以5種氨基糖苷類藥物的色譜峰面積對質(zhì)量濃度作線性回歸，5種藥物在10.0～500 ng/mL范圍內(nèi)線性良好(r＞0.99)，見表3。檢出限(S/N ＞3)為5.0 μg/kg。通過陰性回魚和淡水小龍蝦加標(biāo)測定，添加水平為10.0 μg/kg時，5種氨基糖苷類藥物的信噪比S/N大于10，表明該方法所有的氨基糖苷類藥物的定量下限均可達到 10.0 μg/kg。

表3 5種氨基糖苷類抗生素的線性回歸方程及線性范圍

3.3 方法的回收率和精密度 在陰性回魚和淡水小龍蝦的試樣中添加 10.0、20.0、50.0 μg/kg 三個不同濃度水平的氨基糖苷類混合標(biāo)準(zhǔn)液，進行加標(biāo)回收實驗，每個濃度水平做6個平行性試驗，結(jié)果見表4。陰性回魚樣品中添加5種氨基糖苷類抗生素藥物的選擇離子色譜圖見圖1。

表4 回魚和淡水小龍蝦中5種氨基糖苷類藥物的回收率測定結(jié)果(n=6)

圖1 陰性回魚樣品中添加5種氨基糖苷類藥物的選擇離子色譜圖(加標(biāo)水平50μg/kg)

從表4中的回收率和精密度數(shù)據(jù)可以看出，對于回魚和淡水小龍蝦兩者基質(zhì)，平均加標(biāo)回收率均在63% ～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3% ～14.4%，能夠滿足檢測方法的要求。

將此檢測方法應(yīng)用于出口鯽魚、鯉魚、回魚、黃顙魚、鰻魚、淡水小龍蝦、龍蝦仁等20批樣品，結(jié)果表明樣品中均未檢出鏈霉素等5種氨基糖苷類藥物殘留，表明鹽城市出口水產(chǎn)品基地中大部分水產(chǎn)品用藥情況較好，符合國家對水產(chǎn)品殘留監(jiān)控的要求。

4 結(jié)論

本文建立了水產(chǎn)品中鏈霉素等5種氨基糖苷類抗生素藥物殘留的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。磷酸緩沖溶液溶解樣品，C18離子交換柱一步富集凈化，有效去除基質(zhì)干擾，方法快速簡潔。經(jīng)過優(yōu)化質(zhì)譜條件和前處理方法，獲得了較低的方法檢測限和較高的靈敏度，在實際檢測工作中具有應(yīng)用價值。

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