班付國，吳寧鵬，李慧素，彭 麗，周紅霞

(河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008)

氯苯胍(Robenidine)是一種新型高效合成抗球蟲藥，自1977年在我國研制成功后，因其療效顯著、毒性小，并具有提高增重和飼料利用率的作用，在獸醫(yī)上得到廣泛應(yīng)用。氯苯胍分子式為C15H13C12N5，相對分子質(zhì)量為334，化學(xué)名為1，3－雙－對氯苯叉氨基胍，結(jié)構(gòu)式如圖1。目前，國內(nèi)外對于氯苯胍在雞組織中的殘留消除趨勢的研究較少［1］。本文以雞為受試對象，對氯苯胍在雞組織中的殘留消除規(guī)律作了研究。

圖1 氯苯胍化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試驗動物 健康白來杭雞，SPF級，體重約2 kg，購于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)。飼養(yǎng)溫度10～20℃，每日換水換食，飼養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境。

1.2 儀器 超高效液相色譜 －串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司);SIGMA 3－30K離心機(德國SIGMA公司);Buchi均質(zhì)器。

1.3 藥品與試劑 氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品，含量93.0%，購于德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司;D8－氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品，含量99.3%，購于德國Sigma－Aldrich公司。甲醇、乙腈為色譜純。

1.4 給藥與采樣 選試驗用白來杭雞30只，5只為空白，其他飼喂含氯苯胍500 mg/kg飼料7 d，停藥后的第0、1、3、5、7天隨機各宰殺5只，取肌肉、肝臟、腎臟、皮和脂肪五種組織分別處理。

1.5 測定方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。于－18℃保存。

1.5.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制(1 mg/mL) 精密稱取D8－氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，于10 mL容量瓶中，用二甲亞砜溶解后，用甲醇稀釋至刻度，制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。于－18℃保存。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 量取標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用85%乙腈稀釋，制得濃度為10、20、50、100、200 和500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)溶液均為100 ng/mL)，由低濃度到高濃度，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測組分峰與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測組分濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.5.4.1 色譜條件 色譜柱:Acquity UPLC?BEH C18(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm);柱溫:30℃;流動相:A相為乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測;源溫度120℃;脫溶劑溫度350℃;電離電壓3.0 kV;測試藥物定性、定量離子對及對應(yīng)的碰撞能量見表2。

表2 氯苯胍及D8-氯苯胍定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量

1.5.5 樣品前處理 稱取均質(zhì)后(2±0.02)g試料，置于50 mL離心管內(nèi)，添加100 μL 100 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液，加0.1%甲酸乙腈5 mL，渦旋混合，中速振蕩10 min，7500 r/min離心10 min，取上清液于另一10 mL離心管內(nèi)，加水1 mL，混勻。中性氧化鋁小柱用乙腈2 mL活化，取全部提取液過柱，收集全部流出液于10 mL玻璃試管中，再用85%乙腈2 mL淋洗，合并流出液，于40℃下氮氣吹至體積小于2 mL，再加入水8 mL，備用。HLB固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，取全部備用液過柱并用水3 mL淋洗，抽干30 s，正己烷3 mL淋洗，抽干10 min，甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹干，殘渣用85%乙腈1.0 mL溶解，渦旋，過濾，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5.6 回收率的測定 在雞肌肉、雞肝臟、雞腎臟組織中添加50、100、200 μg/kg 三個不同濃度，在雞脂肪、雞皮中添加 100、200、400 μg/kg三個不同濃度，各濃度進行5個樣品平行試驗，重復(fù)3次，計算回收率。

2 結(jié)果

2.1 氯苯胍、D8－氯苯胍的定量及定性確認(rèn) 氯苯胍、D8－氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試樣溶液及空白添加試樣溶液特征離子質(zhì)量色譜圖分別見圖2－圖4。從圖中可以看出，氯苯胍在此條件下圖譜無干擾。

2.2 線性、檢出限、定量限及回收率 以標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯苯胍峰與D8－氯苯胍內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，氯苯胍濃度為橫坐標(biāo)，作線性回歸方程為:Y=8.9885X+146.89，相關(guān)系數(shù)為 0.9985。氯苯胍在10～500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。五種組織中氯苯胍的檢測限均為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg。在氯苯胍三個不同添加濃度進行的回收率試驗中，氯苯胍在肝臟、肌肉、腎臟、脂肪和皮中平均回收率分別為82.8% ～103.9%，85.0% ～ 107.6%、76.7% ～ 88.3%、80.9% ～91.6%和80.9% ～108.2%(表3)。

表3 空白雞組織中氯苯胍添加回收率試驗(n=5)

2.3 氯苯胍在五種組織中的殘留情況 雞肌肉、雞肝臟、雞腎臟、雞脂肪和雞皮中氯苯胍殘留隨時間的殘留變化情況見表4。從表中可以看出，氯苯胍在雞脂肪中殘留量最高，停藥第0 d的殘留量高達(dá)814.4 μg/kg，而在肌肉中的殘留量最低，僅為39.4 μg/kg。另外，氯苯胍在肌肉中消除速度很快，在停藥后第3天未檢出氯苯胍的殘留。

表4 雞組織中氯苯胍的殘留濃度 μg/kg

3 討論

氯苯胍檢測方法建立的關(guān)鍵在于樣品的凈化。文獻［2］中報道的凈化柱有硅膠柱、陽離子交換柱、C18柱等，通過試驗發(fā)現(xiàn)，采用HLB固相萃取柱進行凈化，可以獲得較好的凈化效果和較低的批內(nèi)、批間標(biāo)準(zhǔn)偏差;同時，脂肪和皮膚需要使用中性氧化鋁固相萃取柱［3－4］和HLB柱用正己烷淋洗相結(jié)合的方法，才能達(dá)到較好的凈化效果。在此基礎(chǔ)上，采用液質(zhì)聯(lián)用的方法對五種組織進行了定量分析。

通過飼喂試驗發(fā)現(xiàn)，雞肌肉組織在停藥后第3天，未檢出氯苯胍殘留，在停藥后第5天，各種組織的殘留量均低于農(nóng)業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》的規(guī)定［5］。從各組織氯苯胍的殘留量上來看，在脂肪中的殘留量最高，其次為肝臟，肌肉中的殘留量最低。在停藥后第7天，除肌肉組織外，其他組織均有檢出，表明氯苯胍在雞體內(nèi)殘留消除較為緩慢。本試驗的研究結(jié)果對保障消費者身體健康，擴大我國動物食品出口具有重要意義，并對藥物代謝動力學(xué)研究具有參考價值，為以后的合理用藥及制定合理的休藥期提供參考。

［1］ Mortier L，Huet A C，Daeseleire E，et al.Deposition and depletion of five anticoccidials in eggs［J］.Agricultural and Food Chemistry，2005，(53):7142 －7149.

［2］ 劉勇軍，吳銀良，姜艷彬.高效液相色譜法測定雞組織與雞蛋中氯苯胍的殘留量［J］.色譜，2010，28(9):905 －907.

［3］ Kot－ Wasik A，Wasik A.Determination of robenidine in animal feeds by liquid chromatography coupled with diode－array detection and mass spectrometry after accelerated solvent extraction［J］.Analytica Chimica Acta，2005，543:46 －51.

［4］ Malgorzata Olejnik，Teresa Szprengier－ Juszkiewicz，Piotr Jedziniak.Multi－residue confirmatory method for the determination of twelve coccidiostats in chicken liver using liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Chromatography A，2009，1216:8141－8148.

［5］ 農(nóng)業(yè)部235號公告.動物性食品中獸藥最高殘留限量［Z］.2002.