黎霜 ，黃可龍，鐘明，魯曼霞

(1.中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙，410083 2.桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)院，廣西 桂林，541004)

卷柏屬植物由于其良好的藥理作用，引起了國內(nèi)外研究者極大的興趣，對其化學(xué)成分進(jìn)行了較深入研究[1?2]。研究表明，卷柏屬植物中含有大量的雙黃酮類化合物，是該屬植物具有藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。自1971年Okigawa等[3]從卷柏 (S.tamariscina)中分離出穗花杉雙黃酮(amentoflavone)、異柳杉雙黃酮(isoeryptomixin)、扁柏雙黃酮(hinokiflavone)、蘇鐵雙黃酮(sotetsuflavone及芹菜素共 5個(gè)黃酮類化合物以來，人們已經(jīng)從卷柏屬植物中分離得到30多個(gè)雙黃酮類化合物[4?8]。雙黃酮類化合物由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而獲得越來越多的關(guān)注。本課題組在對深綠卷柏和兗州卷柏的研究中分別獲得穗花杉雙黃酮，羅伯斯特雙黃酮(robustaflavone)2個(gè)雙黃酮化合物單體；這2個(gè)化合物均為芹菜素的二聚體。二者之間的區(qū)別在于2個(gè)芹菜素之間連接方式不同：穗花杉雙黃酮通過 Ⅰ3′—Ⅱ8″連接，而羅伯斯特雙黃酮?jiǎng)t通過Ⅰ3′—Ⅱ6″連接。連接方式不同造成2個(gè)化合物藥理活性存在明顯差異[9]。但是，由于二者之間結(jié)構(gòu)的相似性，很難用簡單的方法將它們區(qū)別開來；特別是這2個(gè)化合物同時(shí)存在時(shí)，將2種化合物分別定性更加困難。一些研究者對黃酮類化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行了研究。Xu等[10]根據(jù)大豆黃酮苷元和大豆異黃酮苷元在電噴霧?離子阱?飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜負(fù)離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，總結(jié)了2類化合物C環(huán)上的裂解規(guī)律，提出了黃酮化合物的交叉共軛體系和異黃酮的非交叉共軛體系對C環(huán)的裂解影響較大,而且黃酮化合物的B環(huán)和異黃酮化合物的A,B環(huán)上取代基的類型和位置對生成碎片離子的穩(wěn)定性也有影響。Colovic等[11]報(bào)道了C3—C8″ 連接的 Biapigenin 正離子模式下的裂解特征。de Daniel等[12?13]也對 C—O—C 連接的 7,7″—O—dimethyllanaraflavone和 Lonoflavone等雙黃酮化合物的質(zhì)譜裂解特征進(jìn)行報(bào)道。Lin等[7?8]研究了穗花杉雙黃酮和羅伯斯特雙黃酮的質(zhì)譜碎片特征。但是尚未有關(guān)于穗花杉雙黃酮和羅伯斯特雙黃酮質(zhì)譜裂解規(guī)律的報(bào)道。鑒于液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在對卷柏屬植物中穗花杉雙黃酮的定性定量研究的廣泛應(yīng)用[14?15]，對于雙黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究就顯得尤為重要。本文作者應(yīng)用LC-ESI/MS質(zhì)譜儀在負(fù)離子模式下對穗花杉雙黃酮和羅伯斯特雙黃酮質(zhì)譜裂解特征進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)

1.1 儀器

儀器為：Finnigan LCQ DECA XP高效液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Quest Finnigan公司生產(chǎn))包括HPLC系統(tǒng)；P4000 四元泵；UV 6000 LP二極管陣列檢測器(DAD)；電噴霧電離( ESI)接口。

1.2 材料與試劑

穗花杉雙黃酮和羅伯斯特雙黃酮均為本實(shí)驗(yàn)室從兗州卷柏中分離并純化所得。乙腈為色譜純，德國默克公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法和條件

取適量樣品溶解于甲醇中，在負(fù)離子模式下，采用直接進(jìn)樣法進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜分析。離子源溫度為110 °C；脫溶劑氣(N2)流速為350 L/h；錐孔氣(N2)流速為 50 L/h；毛細(xì)管電壓為 3.0 kV；m/z(質(zhì)荷比)為100～600；錐孔電壓為60 V；碰撞氣體為氬氣(Ar)；碰撞室能量為40 V。m/z采集范圍為180～600。

2 結(jié)果與討論

穗花杉雙黃酮與羅伯斯特雙黃酮互為C—C連接的同分異構(gòu)體，廣泛存在于卷柏屬植物中。它們的分子式為：C30H18O10，相對分子質(zhì)量為：538.45，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 穗花杉雙黃酮和羅伯斯特雙黃酮的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of amentoflavone and robustaflavone

穗花杉雙黃酮為Ⅰ3′—Ⅱ8″連接的雙黃酮類化合物，其負(fù)離子模式下的電噴霧質(zhì)譜碎片見圖2。由圖2可知：在負(fù)離子模式下產(chǎn)生的主要碎片離子的質(zhì)荷比m/z為：537.09，493.09，443.19，416.99，374.99，330.99，306.90和203.10。穗花杉雙黃酮分子可能的裂解途徑見圖3。第1種裂解途徑是Ⅰ-A環(huán)的2個(gè)γH 發(fā)生麥?zhǔn)现嘏牛瑏G失C3O2分子，緊接著，Ⅰ-C環(huán)發(fā)生0，4鍵斷裂(0,4A)斷裂，失去C2H2離子，得到m/z=443的碎片離子峰，豐度為 18%。裂解規(guī)律與 Zhang等[16]在對玄參酮的質(zhì)譜研究中的發(fā)現(xiàn)一致。第2種裂解途徑是Ⅱ-C環(huán)的 0，2鍵斷裂(0,2A)，丟失C7H5O2離子碎片，得到豐度為21%，m/z=417的碎片離子。在碎片離子峰中可觀察到1個(gè)豐度約為6%，m/z=331的碎片?？赡苁莔/z=417的碎片離子的Ⅰ-A環(huán)的2個(gè)γH發(fā)生麥?zhǔn)现嘏?，丟失 C3O2碎片的同時(shí)，Ⅰ-B環(huán) C4′位的羥基與Ⅱ-A環(huán)C7″上的羥基出現(xiàn)分子內(nèi)脫水，失去1個(gè)水分子所產(chǎn)生。第3種的裂解途徑為：Ⅱ-C環(huán)出現(xiàn)0，4鍵斷裂(0,4A)，丟失C9H6O3離子，得到m/z=375的碎片離子峰，豐度為70%，這說明此離子碎片峰比較穩(wěn)定。Shi等[17?18]在對不同C—C連接的雙黃酮類化合物的質(zhì)譜研究中觀察到此碎片離子的存在。

羅伯斯特雙黃酮為Ⅰ3′—Ⅱ6″連接的雙黃酮化合物，在負(fù)離子模式下的電噴霧質(zhì)譜碎片見圖4。與穗花杉雙黃酮的質(zhì)譜圖比較，出現(xiàn)3個(gè)不同的碎片離子m/z峰，分別為519.09,308.90,226.90；m/z一致的碎片離子也表現(xiàn)出不一樣的豐度。羅伯斯特雙黃酮分子可能的裂解途徑見圖5。第1種和第3種的裂解途徑與穗花杉雙黃酮一樣，分別得到m/z為443和375的碎片離子，豐度分別為 7%和 100%。2個(gè)分子的芹菜素通過C3′—C6″連接，在質(zhì)譜條件下，Ⅱ-C環(huán)更易于出現(xiàn) 0，4鍵斷裂(0,4A),丟失 C9H6O3離子。此裂解途徑應(yīng)是羅伯斯特雙黃酮的主要裂解途徑。第2種裂解途徑為：Ⅱ-C 環(huán)的 0，2 鍵斷裂(0，2A)，丟失 C7H5O2碎片，得到豐度為30%，m/z=417的碎片離子峰，由于羅伯斯特雙黃酮是C3′—C6″連接，存在空間結(jié)構(gòu)的影響，促使m/z=417碎片進(jìn)一步裂解，于Ⅰ-A環(huán)失去C2H2O分子產(chǎn)生豐度值為79%，m/z=309 的碎片離子，此離子繼續(xù)裂解，于Ⅰ-B環(huán)，Ⅱ-B環(huán)相繼失去2分子的 C2H2O，得到微量的m/z=227 碎片。第4種裂解途徑：與C3′—C8″連接的穗花杉雙黃酮相比，由于空間構(gòu)型的影響，使得羅伯斯特雙黃酮Ⅰ-B環(huán)C4′ 位上的羥基與Ⅱ-B環(huán) C5″或者 7″位上的羥基較容易出現(xiàn)分子內(nèi)脫水，失去1個(gè)水分子，產(chǎn)生m/z=519的碎片，豐度為20%；Ⅱ-C環(huán)0，2鍵斷裂(0,2A)，丟失C7H5O2碎片，得到豐度為22%，m/z=399的碎片；此離子進(jìn)一步裂解，經(jīng)過Ⅰ-A環(huán)的2個(gè)?H 發(fā)生麥?zhǔn)现嘏?，丟失C3O2分子，得到m/z=331的碎片；此碎片離子的Ⅰ-C 環(huán)發(fā)生0，4鍵斷裂(0,4A)斷裂，失去C2H2離子，得到少量的m/z=305碎片離子。m/z=331碎片的豐度40%，提示該離子比較穩(wěn)定。第5種裂解途徑：在質(zhì)譜(圖4)中還可以觀察到豐度約為10%的m/z=493 碎片，可能是Ⅰ-A環(huán)失去CO2分子所致[12]。在穗花杉雙黃酮的質(zhì)譜圖中也能觀察到此碎片離子，但是豐度太小，幾乎可以忽略不計(jì)。說明空間立體構(gòu)型對化合物的質(zhì)譜裂解途徑存在重要影響。豐度為82%，m/z=309碎片離子也進(jìn)一步說明 C3′—C6″連接所造成的空間結(jié)構(gòu)，促使了m/z=417 碎片的進(jìn)一步裂解。與穗花杉雙黃酮的裂解途徑相比較，第4種裂解途徑可能是Ⅰ3′—Ⅱ6″連接的羅伯斯特雙黃酮化合物質(zhì)譜裂解的特征途徑。m/z為519，309以及226的碎片離子即為羅伯斯特雙黃酮的特征碎片離子。

圖2 負(fù)離子模式下穗花杉雙黃酮的質(zhì)譜圖Fig.2 Amentoflavone MS scan spectra obtained in ESI negative ion mode

圖3 穗花杉雙黃酮可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathways of amentoflavone

圖4 負(fù)離子模式下羅伯斯特雙黃酮的質(zhì)譜圖Fig.4 Robustaflavone MS scan spectra obtained in ESI negative ion mode

圖5 羅伯斯特雙黃酮的裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathways of robustaflavone

在黃酮化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律中，C環(huán)上1,3鍵容易斷裂，發(fā)生RDA裂解[9]。 但是，黃酮分子通過C—C連接成雙黃酮分子后，在C3—C8″ 連接的雙黃酮化合物的質(zhì)譜裂解中出現(xiàn)這樣的裂解情況[10]。由于連接位置的關(guān)系，在 C3′—C8″和 C3′—C6″連接的雙黃酮化合物中，C環(huán)上0，2鍵或者0，4鍵更易斷裂。可能的原因是：所產(chǎn)生碎片離子中的電荷密度由于另一個(gè)黃酮分子的大π作用，更易于得到分散。

3 結(jié)論

(1)根據(jù)穗花杉雙黃酮和羅伯斯特雙黃酮在負(fù)離子模式下電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜給出的碎片質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對裂解途徑進(jìn)行理論分析，在一定程度上得到規(guī)律性認(rèn)識(shí)。通過這2種雙黃酮化合物的質(zhì)譜裂解行為，可分別對穗花杉雙黃酮和羅伯斯特雙黃酮進(jìn)行定性 鑒別。

(2)穗花杉雙黃酮和羅伯斯特雙黃酮均為 C—C連接的雙黃酮化合物，它們有著相同的裂解途徑：C環(huán)中的0，4鍵容易發(fā)生斷裂，生成m/z=375的碎片離子。此離子峰為這2個(gè)同分異構(gòu)體的共有特征離子峰。

(3)空間立體構(gòu)型對化合物的質(zhì)譜裂解途徑存在重要影響：與穗花杉雙黃酮的C3′—C8″連接相比較，C3′—C6″連接模式在離子碎片中脫去水分子出現(xiàn)環(huán)化過程。產(chǎn)生m/z=519和m/z=309這2個(gè)羅伯斯特雙黃酮的特征碎片離子；這種連接所造成的空間結(jié)構(gòu)，也促使了碎片離子m/z=417的進(jìn)一步裂解。

致謝：特別感謝實(shí)驗(yàn)室的施樹云老師在譜圖分析方面給予的指導(dǎo)。

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