唐金鳳，魯耀邦，桂柳姿

（湖南中醫(yī)藥大學藥學院，中藥藥性與藥效三級科研實驗室，省中藥現(xiàn)代化研究實驗室，湖南 長沙410208）

黃花石蒜（Lycoris aurea Herb.）系石蒜屬植物，內含生物堿、多糖、黃酮、氨基酸及凝集素等化學成分[1-3]，其中加蘭他敏含量比石蒜屬其他植物高[4]。加蘭他敏是治療阿爾茨海默氏病（AD）的首選藥物之一。臨床研究表明，加蘭他敏可明顯改善AD 患者的認知能力且毒副作用小，其作為治療輕度至中重度AD 的藥物已在歐盟國家上市[5-7]。通過相關文獻研究發(fā)現(xiàn)：七月份的黃花石蒜花中加蘭他敏的含量花中含量最高，莖（花葶）含量最少[8]，另有文獻表明花中花蕊部分加蘭他敏含量最高[9]，提示黃花石蒜不同部位中生物活性物質加蘭他敏合成相關關鍵酶基因及加蘭他敏生物合成代謝途徑存在差異。目前加蘭他敏生物合成代謝途徑尚不明確，本實驗以此為立題依據(jù)，借助近年來檢測基因的一種高效方法—mRNA 差異顯示技術（DD-PCR）[10]，研究黃花石蒜的花蕊與花葶的差異表達，并對其克隆進行生物信息學分析，為黃花石蒜中加蘭他敏合成代謝提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃花石蒜采自于湖南衡山，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室潘清平教授鑒定為石蒜科石蒜屬植物Lycoris aurea Herb.。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒購自TIANGEN 公司；26 條隨機引物和3 條錨定引物購自上海生物工程有限公司；反 轉 錄 酶M-MLV，RNasin Inhibitor 購 自Promega 公司；QIAEX Gel Extraction Kit 購自美國QIAGEN 公 司；PMD19-T Vector 購 自TaKaRa 公司。

1.3 方法

1.3.1 黃花石蒜花蕊與花葶總RNA 的提取 參照TIANGEN 植物總RNA 提取試劑盒的說明書進行操作[11]。

1.3.2 cDNA 合成 參照M-MLV 試劑說明書操作，反轉錄所用的錨定引物與PCR 所用的錨定引物一致，最后將合成的cDNA 保存于-20 ℃。

1.3.3 差異顯示PCR 用3 種錨定引物與26 種隨機引物的不同組合，分別以花蕊和花葶的反轉錄產(chǎn)物為底物進行156 個PCR 反應[11]。

1.3.4 差異顯示片段的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） PCR 產(chǎn)物在6%PAGE 膠上電泳，將PCR產(chǎn)物與6×loading buffer 以4∶1 比例混勻，上樣，以8V/cm 的恒定電壓電泳至溴酚藍移出膠外，二甲苯氰FF 離膠底部1.5 cm 處，停止電泳。對凝膠進行染色參照梁宏偉等[12]改良的銀染方法，于26 ℃60 r/min 震蕩箱中振搖顯影。用GIS-1000B Tanon 凝膠成像系統(tǒng)觀察照相并保存圖片。

1.3.5 PAGE 電泳差異顯示片段的回收及回收片段的第二次PCR 反應 參照王永成等[13]的方法略有改進，用無菌水清洗膠若干次，將差異條帶用消毒后的手術刀片切下并編號；用無菌水清洗條帶2 次，每次200 μL；用滅菌的Tip 頭將膠碾碎；加入30 μL無菌水，用封口膜將管口封嚴；沸水中煮8 min；4 ℃12 000 r/min 離心2 min，取3～4 μL 上清液進行第二次PCR，第二次PCR 反應體系與條件同第一次PCR 反應。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.3.6 回收片段的克隆 （1）回收片段二次PCR 產(chǎn)物的純化：參考QIAGEN 的瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明書中具體步驟進行。（2） 純化產(chǎn)物的連接反應：參照TaKaRa 公司的PMD19-T Vector 說明書進行操作。（3）克?。簠⒄仗战艿萚14]的方法進行。將克隆所得的陽性菌液送上海博尚公司進行測序。

1.3.7 差異顯示片段序列比對及分析 在GenBank數(shù) 據(jù) 庫（網(wǎng) 址 為：http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中，將所測序列通過BLASTN 軟件及BLASTX 軟件進行分析，尋找與其它蛋白序列的同源性。

2 結果

2.1 mRNA 差異顯示PCR

以隨機引物與錨定引物配對，擴增cDNA，用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異條帶，如圖1所示。

圖1 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 差異條帶的第二次擴增及凝膠回收

從6%聚丙烯酰胺凝膠中回收差異條帶，并進行第二次PCR 擴增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，證實其為單一條帶，如圖2所示。通過QIAGEN 公司提供的普通瓊脂糖凝膠電泳DNA 回收試劑盒回收差異條帶用于克隆。

圖2 差異條帶瓊脂糖凝膠回收電泳圖

2.3 差異條帶克隆及轉化子的鑒定

將回收的差異DNA 條帶連接至PMD19-T 載體中，轉化后，將菌落進行PCR，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，證實重組質粒中含有插入的目的基因片段（如圖3）。

圖3 目的基因的鑒定電泳圖

2.4 差異條帶的序列分析及同源性比較

本試驗最終得到44 條差異條帶，通過BLASTN數(shù)據(jù)庫及BLASTX 數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其中C290115 與快速堿化因子前體、C270614-2 與脫乙酰酶組蛋白14、C271212-2 與I 類熱休克蛋白有較高的同源性。BLASTN 及BLASTX 比對如表1。

表1 差異片段在GenBank 中Blastn 及Blastx 分析

3 討論

目前，對黃花石蒜的研究主要致力于愈傷組織培養(yǎng)[15-17]和化學成分[1-3]及植物組織中加蘭他敏的定位方面[18]，而未見加蘭他敏生物合成代謝途徑方面的研究報道。本試驗旨在從基因轉錄水平研究加蘭他敏生物合成代謝途徑。我國20世紀60年代開始石蒜堿高含量植物的尋找工作，對石蒜屬植物鱗莖中加蘭他敏的含量測定的結果表明，黃花石蒜為石蒜屬植物中加蘭他敏的含量最高的物種之一[19]。7月份黃花石蒜花中加蘭他敏含量最高，根次之，鱗莖和莖（花葶）中含量最少[8]，此結果與李子璇等[9]發(fā)現(xiàn)結果一致，說明這個時期同一生存條件下石蒜中的加蘭他敏主要富集于生殖器官，尤其花蕊中；8月份的黃花石蒜不同部位中加蘭他敏主要集中在鱗莖中，須根、葉、花、花苔中則含量較少[21]，說明這一時期下鱗莖是加蘭他敏的主要儲存部位。本試驗通過比較7月份的黃花石蒜花蕊和花葶的基因轉錄水平上存在差異，篩選出的三個同源序列中其中快速堿化因子前體基因和脫乙酰酶組蛋白14 基因同源序列可能與加蘭他敏的生物合成代謝途徑有關，其功能的驗證有待后續(xù)實驗的進行。在黃花石蒜的花蕊中還克隆出熱休克蛋白基因，推測其可能因外界氣溫的變化而調控加蘭他敏的代謝及運輸，此結果有待進一步研究。差異顯示DD-PCR 克隆出的44 個差異條帶中，大部分為未知，有待進一步驗證及分析。

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