姚 紅，楊飛燕，劉昌盛，陳瑞旦，童 娟

（廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510120）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis)又稱為尿酸性關(guān)節(jié)炎，是由尿酸鈉(monosodiumurate，MSU)在關(guān)節(jié)腔內(nèi)形成微晶體沉淀，引起非特異性關(guān)節(jié)炎癥，痛風(fēng)最常見的表現(xiàn)形式是以關(guān)節(jié)紅腫熱痛的炎癥反應(yīng)為主[1]，屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”之風(fēng)濕熱痹范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示：急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作與自身免疫介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作時(shí)，尿酸鹽晶體刺激血液中單核細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑液中的多形核白細(xì)胞引起白介素-1（interleukin-1 IL-1）的大量釋放是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作的特點(diǎn)，故IL-1 是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要炎癥介質(zhì)[2]，關(guān)節(jié)內(nèi)主要是以白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）形式存在，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中起重要作用[3]。但關(guān)于中醫(yī)藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究中，重點(diǎn)往往關(guān)注藥物對(duì)人體內(nèi)血尿酸濃度的影響，而忽略了中藥抗炎作用的效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)用尿酸鈉晶體注射大鼠踝關(guān)節(jié)內(nèi)誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，主要觀察濕痹通對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥程度、血清內(nèi)及關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1 及IL-1R 水平的影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar 大鼠40 只，雄性，180～200 g（由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為scxk 粵2006-0015），飼養(yǎng)環(huán)境：廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室（許可證：4402100561）。

1.1.2 藥物 濕痹通由廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室提供（為院內(nèi)制劑，由七葉蓮、土茯苓、萆薢組成，經(jīng)煎煮后減壓濃縮至2 g/mL，冰箱保存?zhèn)溆茫?。秋水仙堿(50 mg/片，西雙版納藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，No.H53021369)。

1.1.3 試劑 尿酸鈉（美國(guó)Sigma 公司）；大鼠IL-1及白細(xì)胞介素-1R（IL-1R）ELISA 試劑盒（購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司）；大鼠免疫組化試劑盒（購(gòu)自廣州杰特偉生物科技有限公司），抗IL-1β 抗原（ab109555 Abcam 抗體），抗IL-1R 抗原（ab106278 Abcam 抗體），DAB 顯色試劑盒。

1.1.4 儀器 DF-110 型電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司生產(chǎn)）；游標(biāo)卡尺 （上海實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司生產(chǎn)）；pH 計(jì)（編號(hào)DECTA320，瑞士梅勒公司生產(chǎn)）；套式恒溫器（GB2292 型，美國(guó)Janis 公司生產(chǎn)）；振蕩混合器（上海醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn)）；高速冷凍離心機(jī) （型號(hào)KR-180 FA，上海醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn)）；鱟試驗(yàn)微生物檢測(cè)儀ELx808(配套IU)（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司生產(chǎn))；TALgent 專業(yè)分析軟件（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 尿酸鈉結(jié)晶及尿酸鈉溶液的制備 無菌條件下將800 mg 尿酸鈉和155 mL 生理鹽水混合，置于燒瓶中用電爐加熱煮沸至尿酸鈉完全溶解，迅速小滴滴入1 mol/L 的鹽酸調(diào)整pH 6.8～7.2，自然降溫后于3 000 r/min 離心，離心至晶體不再析出后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前離心后再將晶體混懸于PBS 中配成所需濃度，采用鱟試劑動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)內(nèi)毒素（內(nèi)毒素＜0.062 5 Eu/mL）。

1.2.2 藥物制備 將七葉蓮、土茯苓、萆薢3 味藥按等劑量比列放置在套式恒溫器中，加入10 倍藥材量的蒸餾水，武火煮沸后改文火煎煮2 h，濾出藥液，藥渣加入8 倍蒸餾水繼續(xù)煎煮2 h，兩次濾液合并，蒸餾懸蒸濃縮藥液至2 g/mL，冰箱保存?zhèn)溆?，用前加蒸餾水配成所需濃度。

1.2.3 動(dòng)物模型的制備 采用改良后的Cdoerre大鼠動(dòng)物模型造模方法[4]。大鼠腹腔注射水合氯醛30 mg/kg 麻醉，選受試大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)，常規(guī)消毒后，用4.5 號(hào)注射針與脛骨成45°方向插入踝關(guān)節(jié)，將0.1 mL 尿酸鈉溶液（50 mg/mL）注入到踝關(guān)節(jié)腔，形成大鼠關(guān)節(jié)局部紅腫熱痛并不同程度的跛行，即成大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

1.2.4 動(dòng)物分組及給藥方法 Wistar 雄性大鼠40只按體重隨機(jī)分為5 組，每組8 只，給藥劑量均按60 kg 成人體表面積換算[5]。設(shè)為空白組、模型組、秋水仙堿組[0.009 g/（kg·d）]、濕痹通低劑量組[27 g/（kg·d）]、濕痹通高劑量組[54 g/（kg·d）]。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后開始造模，空白組不做任何處理，余4 組大鼠按照動(dòng)物模型的制備方法制造大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。造模后當(dāng)天開始連續(xù)灌胃7 d，在每天早上9 點(diǎn)秋水仙堿組、濕痹通各劑量組分別灌胃相應(yīng)藥物，空白組及模型組予以蒸餾水10 mL/（kg·d）灌服。于第7 天灌胃后3 h 處死大鼠取材。

1.2.5 炎癥指數(shù)及功能障礙指數(shù) 根據(jù)Coderre 炎癥指數(shù)及功能障礙指數(shù)分級(jí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[6]，造模后8、72 h 分別觀察大鼠炎癥指數(shù)及功能障礙指數(shù)。

①炎癥指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 分 正常；1 分 關(guān)節(jié)皮膚紅斑，輕度腫脹，骨性標(biāo)志可見；2 分 關(guān)節(jié)明顯紅腫，骨性標(biāo)志消失，但腫脹局限于關(guān)節(jié)部位；3 分 關(guān)節(jié)以外肢體腫脹；②功能障礙指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 分 正常步態(tài)，雙足均勻著地；1 分 足著地減輕，足趾未展開，輕度跛行；2 分 足屈起，趾背著地，明顯跛行；3 分 足完全離地，三足步態(tài)。

1.2.6 血清IL-1、IL-1R 含量的測(cè)定 （ELISA 法）大鼠末次灌胃后3 h，用10%水合氯醛以3 mL/kg腹腔麻醉后，腹主動(dòng)脈取血5 mL，3 000 r/min，離心15 min，分離血清待測(cè)。

1.2.7 關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)IL-1β、IL-1R （免疫組化法）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，過氧化氫去內(nèi)源性酶，胰酶消化暴露抗原，滴加一抗4 ℃孵育過夜，依次滴加生物素標(biāo)記二抗、酶標(biāo)記鏈霉卵白素過氧化物酶，DAB 顯色。采用Image Pro-Plus6.0 圖像處理分析軟件對(duì)圖片上棕黃色像素點(diǎn)的強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析。在400 倍光鏡下每張切片隨機(jī)選擇3 個(gè)不重疊視野，將呈現(xiàn)棕黃色區(qū)域視為陽性目標(biāo)，測(cè)量出累積光密度總值(IOD SUM)，同時(shí)測(cè)量上述3 個(gè)視野的染色陽性面積（area），將IOD SUM 與area 的比值作為平均光密度 （mean density） 值，即mean density=(IOD SUM)/area。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠炎癥指數(shù)及功能障礙指數(shù)積分比較

模型組炎癥指數(shù)及功能障礙指數(shù)積分均比其它各用藥組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造模后72 h 比造模后8 h 各組積分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

2.2 各組大鼠血清中IL-1 及IL-1R 含量的比較

各組IL-1 與IL-1R 的含量，模型組高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各用藥組低于模型組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而各用藥組與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各用藥組之間比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠炎癥指數(shù)積分及功能障礙指數(shù)積分比較（n=8，±s，分）

表1 各組大鼠炎癥指數(shù)積分及功能障礙指數(shù)積分比較（n=8，±s，分）

注：與模型組比較▲P＜0.05；造模后72 h 與8 h 比較※P＜0.05。

藥物劑量（g/kg）組 別空白組模型組秋水仙堿組濕痹通低劑量組濕痹通高劑量組— —0.009 27 54炎癥指數(shù)造模后8 h 造模后72 h 0 0 2.5±0.53 1.8±0.71※2.0±0.00▲ 1.0±0.53▲※1.9±0.35▲ 0.9±0.64▲※1.8±0.46▲ 1.0±0.53▲※功能障礙指數(shù)造模后8 h 造模后72 h 0 0 2.5±0.53 1.8±0.71※2.1±0.83 0.9±0.83▲※2.0±0.76 0.9±0.64▲※1.9±0.64 0.6±0.74▲※

表2 各組大鼠血清IL-1、IL-1R 含量的比較（n=8，±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清IL-1、IL-1R 含量的比較（n=8，±s，pg/mL）

注：與空白組比較▽P＜0.05；與模型組比較▲P＜0.05。

組 別空白組模型組秋水仙堿組濕痹通低劑量組濕痹通高劑量組藥物劑量（g/kg）— —0.009 27 54 IL-1 0.057±0.006 0.101±0.013▽0.064±0.012▲0.066±0.014▲0.057±0.012▲IL-1R 0.055±0.006 0.079±0.012▽0.058±0.013▲0.066±0.005▲0.056±0.008▲

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織中IL-1β、IL-1R 表達(dá)的比較

模型組、秋水仙堿組、濕痹通各劑量組與空白組的IL-1β、IL-1R 平均光密度值比較均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各用藥組平均光密度值比模型組降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。濕痹通低劑量組與秋水仙堿組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組與濕痹通高劑量組比較，高劑量組的平均光密度值下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)果見表3。大鼠關(guān)節(jié)軟組織免疫組化光鏡圖（見圖1～2）。

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織IL-1β、IL-1R 表達(dá)的比較 （±s，pg/mL）

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織IL-1β、IL-1R 表達(dá)的比較 （±s，pg/mL）

注：與空白組比較＃P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.05；與高劑量組比較★P＜0.05。

藥物劑量（g/kg）組 別空白組模型組秋水仙堿組濕痹通低劑量組濕痹通高劑量組— —0.009 27 54 IL-1β 29.09±19.49 151.09±5.03＃122.46±14.55＃▲★124.72±13.37?！?4.44±12.32＃▲IL-1R 16.05±15.12 184.82±31.49＃132.32±28.65?！?38.54±7.75＃▲★82.47±28.85?！?/p>

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織IL-1β 免疫組化光鏡圖（×400）

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織IL-1R 免疫組化光鏡圖（×400）

3 討論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是尿酸鹽在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織以結(jié)晶形式沉積引起的急性炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用公認(rèn)的大鼠踝關(guān)節(jié)內(nèi)注入尿酸鈉晶體溶液制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病變模型的方法，造模后大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱和功能障礙等表現(xiàn)，其病理表現(xiàn)與臨床急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎極為相似，充分地模擬了人類急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病變過程。同時(shí)，造模后模型組大鼠炎癥指數(shù)及功能障礙指數(shù)積分均比空白組升高（P＜0.05），也進(jìn)一步說明造模方法是成功的。而造模后72 h 比造模后8 h 各組積分有所降低 （P＜0.05），預(yù)示急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎癥在自身免疫調(diào)節(jié)下有自行緩解的趨勢(shì)。

在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)中，人體免疫系統(tǒng)起到至關(guān)重要的作用，尿酸鹽晶體刺激血液中單核細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑液中的多形核白細(xì)胞引起IL-1的大量釋放是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作的特點(diǎn)，是關(guān)節(jié)破壞的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過程中起重要作用[7]。IL-1 分為膜結(jié)合型白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)和可溶型(IL-1β)2 種。IL-1β 存在于在關(guān)節(jié)組織中（包括滑膜、滑液及軟骨），是最經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)的始動(dòng)因素[8-9]。有研究表明，IL-1β 作為主要的炎癥趨化因子和激活因子，可以活化巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞并增強(qiáng)其活性，并可以刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成IL-1β 誘導(dǎo)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。因此對(duì)于IL-1 與IL-1R 在體內(nèi)及關(guān)節(jié)內(nèi)含量的比較，可確定急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥控制的效果。

濕痹通是我們臨床以袪濕除痹立法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)方，通過觀察其對(duì)大鼠體內(nèi)血清及關(guān)節(jié)組織內(nèi)IL-1、IL-1R 表達(dá)的影響，探討濕痹通抗炎作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠血清中IL-1、IL-1R 的含量升高，濕痹通與秋水仙堿均能降低血清IL-1、IL-1R 的含量（P＜0.05）；大鼠關(guān)節(jié)軟組織炎癥細(xì)胞因子水平的比較提示：濕痹通各劑量組、秋水仙堿組大鼠關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)IL-1β、IL-1R 平均光密度值均低于模型組（P＜0.05），說明實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)IL-1β、IL-1R 均具有抑制作用，且濕痹通高劑量組效果更為明顯（P＜0.01）。說明濕痹通可用于該病的急性期治療，其作用機(jī)制可能通過阻斷血清及關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)IL-1、IL-1R 的表達(dá)而改善大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[1]葉仁群，林國(guó)彬，宋曉容，等.清熱利濕活血法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者IL-6 和TNF-α 的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（4）：845-847.

[2]曹世霞，祝 捷，張三印，等.秦皮總香豆素對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型IL-1β、IL-8、TNF-α 的影響[J].四川中醫(yī)，2011，29（3）：68-70.

[3]關(guān)雪峰，劉元祿.清熱解毒方藥對(duì)兔膝急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL- 1β 影響的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（4）：829-831.

[4]姚 麗，劉樹民，于書儀.痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的改良[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，17（3）：210-212.

[5]趙 偉，孫國(guó)志.不同種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間用藥量換算[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2010，5（12）：51-53.

[6]Terkeltaub R.Pathogenesis and treatment of crystal induced inflammation.In: Koopman WJ.Arthritis and allied conditions: a textbook rheumatology [M].Baltimore: William，s and wilkins，1996：2 085-2 102.

[7]Chen CJ，Shi Y，Hearn A，et al.MyD88-dependent IL-1 receptor signaling is essential for gouty inflammation stimulated by monosodium urate crystals.[J].Clin Invest，2006，116 （8）：2 262-2 271.

[8]LA O＇Neill.The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily:10 years of progress[J].Immunol Rev，2008，226（12）:10-18.

[9]吳紅娟，孫必強(qiáng)，朱傳湘，等.鹽酸青藤堿對(duì)家兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE-2 生成與關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（9）:84-86.

[10]Timmer TC，Baltus B，Vondenhoff M，et a1.Inflammation and eetopic lymphoid structures in rheumatoid arthritis synovial tissues dissected by genomics technology：identification of the interleukin -7signaling pathway in tissues with lymphoid neogenesis[J].Arthritis Rheum，2007，56(8)：2 492-2 502.