黃小平，譚 華，劉文龍，鄧常清

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208）

HUANG Xiao-ping1，TAN Hua1，LIU Wen-long2，DENG Chang-qing1

(1.Medical College，TCM University of Hunan，Changsha，Hunan 410007，China;2.Pharmaceutical College，TCM University of Hunan，Changsha，Hunan 410208，China)

黃芪和三七是治療心腦血管疾病的常用中藥。藥物化學(xué)研究表明，黃芪總苷（Astragalosides，AST）是黃芪中具有心腦血管藥理作用的主要藥效物質(zhì)，其主要有效成分是黃芪甲苷。三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是三七中具有心腦血管效應(yīng)的主要藥效物質(zhì)，主要含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 和三七皂苷R1。臨床常將黃芪和三七配伍組成復(fù)方用于腦梗死的治療，且取得了較好效果[1]，但傳統(tǒng)的生藥配伍存在機(jī)制不明確、成分不清楚、質(zhì)量不可控、效應(yīng)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。腦缺血后由于腦組織急性缺血缺氧，導(dǎo)致能量代謝障礙，因此，在腦缺血后盡快恢復(fù)腦血流，改善腦組織能量代謝，是防止腦組織進(jìn)一步損傷的重要措施。已有的研究表明，黃芪總苷能改善缺血心肌組織的能量代謝[2]，三七總皂苷能明顯延緩缺血腦組織ATP 的分解，改善能量負(fù)荷[3]。我們前段研究表明，AST 110 mg/kg和PNS 115 mg/kg 分別是抗腦缺血損傷的有效劑量，且兩者配伍對(duì)氧化應(yīng)激損傷有協(xié)同或相加的效應(yīng)[4]。因此，為繼續(xù)探討AST 和PNS 配伍抗腦缺血的作用機(jī)制，從能量代謝水平研究了該有效劑量配伍對(duì)腦缺血再灌注障礙的影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)C57BL／6 小鼠120 只，雄性，質(zhì)量（20±2）g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（2009-0004）。飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃，濕度50%～60%的環(huán)境。動(dòng)物的處理與中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部關(guān)于“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用指導(dǎo)意見”相一致。

1.1.2 藥物及含量 AST 是由豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bunge 的根中提取而得，購(gòu)自成都和康藥業(yè)有限責(zé)任公司 （批號(hào)HK080302），其含量為45%，原始植物保存于成都和康藥業(yè)有限公司標(biāo)本室。AST 用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉配成相應(yīng)濃度混懸液。

PNS 是由五加科植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen.的主根或根莖中提取的皂苷類成分，購(gòu)自廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司（批號(hào)080628），其含量為93.8%，原始植物保存于廣西梧州制藥（集團(tuán)） 股份有限公司標(biāo)本室。PNS 用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉配成相應(yīng)濃度混懸液。

依達(dá)拉奉 （3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，3-Methyl-1-phenyl-2- pyrazolin-5-one），南京先聲東元制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)80-090104，以生理鹽水配成400 μg/mL 溶液。

1.1.3 試劑 超微量Na+-K+ATP 酶測(cè)試盒，總蛋白定量測(cè)試盒，均購(gòu)自南京建成生物工程公司。三磷酸腺苷 （ATP）、二磷酸腺苷 （ADP）、一磷酸腺苷（AMP）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（進(jìn)口分裝）由天津一方有限公司提供。其他試劑均為分析純。

1.1.4 儀器 C18-WP 液相柱（產(chǎn)地：上海，型號(hào)：Athena）；紫外分光光度計(jì)（產(chǎn)地：瑞士，型號(hào)：VATROPEC4300PRO）；高效液相色譜儀（產(chǎn)地：美國(guó)，型號(hào)：Agilent）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配伍劑量的確定 根據(jù)我們的試驗(yàn)，AST 在30～240 mg/kg 和PNS 在80～320 mg/kg 劑量范圍下灌胃給藥具有抗小鼠腦缺血的作用，且AST 110 mg/kg 和PNS 115 mg/kg 配伍可以協(xié)同抗腦缺血再灌注后腦組織氧化應(yīng)激損傷[4]，故擬定AST 和PNS 的配伍劑量為AST 110 mg/kg+PNS 115 mg/kg。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方法 將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型對(duì)照組，AST 組(110 mg/(kg·d)，ig)，PNS組 （115 mg/(kg·d)，ig）、AST+PNS 配 伍 組（AST 110 mg/(kg·d)+PNS 115 mg/(kg·d)，ig） 及依達(dá)拉奉組 （8 mg/(kg·d)，ip），每組10 只。依達(dá)拉奉組以4 mg/kg 腹腔注射給藥（給藥體積10 mL/kg），每日2 次；假手術(shù)組、模型對(duì)照組予0.5%羧甲基纖維素鈉10 mL/kg 灌胃，其余各組以相同體積灌胃給藥，每日1 次，上午8 點(diǎn)給藥，連續(xù)4 d。各組在第4 天給藥1 h 后造模，術(shù)前12 h 禁食。

1.2.3 腦缺血模型的建立 按文獻(xiàn)方法[5]制備腦缺血再灌注模型，用動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min，再灌注1 h，假手術(shù)組也進(jìn)行同樣手術(shù)，但不阻斷頸總動(dòng)脈進(jìn)行腦缺血。于再灌注1 h 后，將小鼠迅速斷頭，去除小腦及腦干后，腦組織待測(cè)。

1.2.4 腦組織腺苷酸含量測(cè)定 首先，切得視交叉前冠狀腦組織約60 mg，加冷5%高氯酸（腦組織：5%高氯酸=1∶9） 制成10%組織勻漿，4 ℃離心15 min （15 000 r/min），取 上 清 液0.4 mL 加 入3 mol/L 的K2CO30.06 mL，以10% NaHCO3調(diào)節(jié)pH 至中性，4 ℃離心5 min（3 000 r/min），取上清液進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相：pH 6.0 的100 mmol/L 磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液。精密稱 取 標(biāo) 準(zhǔn) 品ATP 16.4 mg，ADP 15.0 mg，AMP 13.1 mg，置同一50 mL 的容量瓶中，用流動(dòng)相溶解、定容，得濃度分別為ATP 328.0 μg/mL、ADP 300.0 μg/mL 和AMP 262.0 μg/mL 的對(duì)照品混合溶液。分別吸取1、2、3、4、5 μL 對(duì)照品混合溶液，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。再取上述處理的樣品進(jìn)樣10 μL 并進(jìn)行色譜分析，根據(jù)峰面積計(jì)算ATP、ADP、AMP 含量。按公式計(jì)算[6]TAN、EC：

TAN=[ATP]+[ADP]+[AMP]，EC=（[ATP]+0.5×[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）。

1.2.5 腦組織Na+-K+-ATP 酶活性測(cè)定 取視交叉后腦組織，加冷生理鹽水（腦組織∶生理鹽水=1∶9）制備成10%的組織勻漿，4 ℃離心5 min （1 000 r/min），取上清液按定磷法測(cè)定Na+-K+-ATP 酶活性，蛋白濃度測(cè)定采用考馬斯亮蘭法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組ATP、ADP 含量和TAN 值顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，ATP 含量在各治療組顯著升高（均P＜0.01），且配伍組比AST 組和PNS 單用組升高更顯著 （均P＜0.01）；與模型組比較，ADP 含量在AST 組、配伍組及依達(dá)拉奉組均升高顯者(P＜0.01，P＜0.05)，且配伍組ADP 的升高比AST、PNS 單用組更多 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，TAN 值在AST+PNS 配伍組和依達(dá)拉奉組顯著升高 （均P＜0.05）；在AST-PNS配伍組和依達(dá)拉奉組ATP、ADP 含量和TAN 值差異不顯著（均P＞0.05）。析因設(shè)計(jì)方差分析顯示AST和PNS 配伍對(duì)ATP、ADP 和TAN 有交互作用 （均P＜0.01）且配伍組的效應(yīng)大于單用AST 和單用PNS效應(yīng)之和，表明AST 110 mg/kg 與PNS 115 mg/kg配伍在抑制ATP、ADP 和TAN 含量降低方面有協(xié)同的交互作用。AMP 含量各組間差異均無顯著性意義（P＞0.05）。

與假手術(shù)組比較，模型組EC 值顯著降低 （P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組腦組織EC 值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01)，與AST 組和PNS 單用組比較，AST+PNS 配伍組腦組織EC 值升高顯著（P＜0.05，P＜0.01），EC 值在配伍組和依達(dá)拉奉組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。析因設(shè)計(jì)方差分析顯示AST 和PNS配伍對(duì)EC 有交互作用（P＜0.05）且AST+PNS 配伍組的效應(yīng)約等于單用AST 和單用PNS 效應(yīng)之和，表明AST 110 mg/kg 與PNS 115 mg/kg 配伍在抑制EC 降低方面有相加的交互作用。

與假手術(shù)組比較，模型組腦組織Na+-K+-ATP 酶活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，AST+PNS 配伍組、AST 組和依達(dá)拉奉組腦組織Na+-K+-ATPase活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01），且AST+PNS 配伍組效應(yīng)比PNS 組更好（P＜0.05）。AST+PNS 配伍組和依達(dá)拉奉組間相比較差異沒有明顯不同（P＞0.05）。析因設(shè)計(jì)方差分析顯示AST 和PNS 配伍對(duì)Na+-K+-ATPase 有交互作用（P＜0.05），且配伍組的效應(yīng)大于單用AST 和單用PNS 效應(yīng)之和，表明AST 110 mg/kg 與PNS 115 mg/kg 配伍在抑制Na+-K+-ATPase活性降低方面有協(xié)同的交互作用。結(jié)果見表1。

表1 各組間小鼠腦組織中ATP、ADP、AMP 含量、TAN、EC 值和Na＋-K＋-ATP 酶活性的比較 （±s，n=10）

表1 各組間小鼠腦組織中ATP、ADP、AMP 含量、TAN、EC 值和Na＋-K＋-ATP 酶活性的比較 （±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較★P＜0.05，★★P＜0.01；與AST+PNS 配伍組比較☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組 別假手術(shù)模 型AST PNS AST+PNS依達(dá)拉奉A(yù)TP(10-3μg/g 組織）291.3±35.0 125.4±14.2△△171.9±19.6★★☆☆167.5±47.9★★☆☆227.3±15.2★★233.5±39.2★★ADP(10-3μg/g 組織）262.2±52.2 194.3±57.7△248.1±57.0★☆219.6±45.4☆☆285.7±64.7★★263.6±62.7★★AMP(10-3μg/g 組織）596.0±89.3 600.5±52.2 530.2±91.5 585.6±114.8 549.7±77.5 583.3±143.8 TAN(10-3μg/g 組織）1 149.2±99.6 920.1±109.7△△960.2±126.9 972.7±169.7 1 061.7±104.3★1 080.4±183.8★EC 0.37±0.04 0.25±0.02△△0.32±0.02★★☆0.29±0.02★☆☆0.35±0.02★★0.34±0.06★★ATP 酶（μmol.Pi/mg.Pr）4.45±1.49 2.34±0.6△△3.29±0.9★3.03±0.61☆4.08±0.96★★3.38±0.92★

3 討論

腦是體內(nèi)能量代謝最活躍的器官，血流量與耗氧量都大，對(duì)缺血、缺氧損傷極為敏感。一旦腦血流供應(yīng)中斷，能量耗竭，會(huì)立即引起腦功能喪失和腦組織的廣泛損傷。

ATP 作為腦組織的主要能量來源，對(duì)于維持細(xì)胞的生理功能發(fā)揮著重要作用。腺苷酸池（TAN）水平和能荷值（EC）是衡量機(jī)體、組織和細(xì)胞代謝狀態(tài)的重要參數(shù)，TAN 的大小反映了線粒體的氧化呼吸活性和生成高能磷酸化合物的能力，EC 是動(dòng)態(tài)反映細(xì)胞能量平衡的一個(gè)參數(shù)[7]，可有效評(píng)估組織細(xì)胞的能量?jī)?chǔ)備狀態(tài)。能荷值高，說明細(xì)胞內(nèi)ATP 生成活躍，反之則表明ATP 生成不足或利用增加。腦缺血再灌注使腦組織內(nèi)葡萄糖和氧供應(yīng)不足，有氧氧化發(fā)生障礙，ATP 含量下降，ATP 分解產(chǎn)物ADP、AMP 含量增加，隨后ADP、AMP 相繼分解，最終導(dǎo)致TAN 水平的變化和EC 值顯著下降，從而引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸釋放增加、自由基增多以及有氧氧化障礙等[8]。

Na+-K+-ATP 酶催化水解ATP 釋放磷酸鹽，直接供給自由能。其活性能反映機(jī)體能量代謝水平和生理功能狀態(tài)。腦缺血時(shí)，ATP 含量下降，大量自由基產(chǎn)生及興奮性氨基酸的釋放，導(dǎo)致該酶的結(jié)構(gòu)破壞[9]，使其功能下降，ATP 生成更趨減少，使原已存在的能量匱乏更加嚴(yán)重，導(dǎo)致ATP 酶活性進(jìn)一步降低，加重腦損傷[10]。

以往研究證明AST 及其有效成分黃芪甲苷可對(duì)抗腦缺血后的氧化應(yīng)激損傷[11]，抑制腦缺血后血腦屏障通透性升高和心肌細(xì)胞能量代謝障礙[12，2]。PNS 及其有效成分人參Rg1 有抗腦缺血再灌注后氧化損傷[13]和抑制鈣離子超負(fù)荷，改善能量負(fù)荷的作用[14]。有關(guān)AST 和PNS 配伍對(duì)腦缺血后腦組織能量代謝的影響還未見研究報(bào)道。本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注1 h 后，腦組織ATP 和ADP 含量、EC和TAN 值顯著下降，Na+-K+-ATP 酶活性降低，說明缺血再灌注后腦組織的能量代謝發(fā)生嚴(yán)重障礙，AST 可提高ATP、ADP 含量，EC 值以及Na+-K+-ATP酶 活 性，PNS 可 提 高ATP 含 量，EC 值 和Na+-K+-ATP 酶活性，AST+PNS 配伍組可提高ATP、ADP 含量，TAN、EC 值以及Na+-K+-ATP 酶活性。且AST+PNS 配伍組對(duì)ATP、ADP 含量、EC 值和Na+-K+-ATP酶活性的效應(yīng)比AST 或PNS 單用組效應(yīng)更好，AST和PNS 配伍在抑制腦缺血再灌注后ATP、ADP 含量，TAN 值的下降方面有協(xié)同的交互作用，在抑制EC 值和Na+-K+-ATP 酶活性的降低方面有相加的交互作用。表明AST 和PNS 配伍使用可以協(xié)同改善腦缺血后腦組織能量代謝，其機(jī)制可能與AST 和PNS 通過抗氧化應(yīng)激損害和改善腦血流來協(xié)同延緩腦缺血后ATP 利用和生成、改善能量負(fù)荷、增強(qiáng)Na+-K+-ATP 酶的活性有關(guān)。

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