王 立，梁清華，陳曉玲，陽(yáng) 歷，唐 科，劉建軍，貝玉章

（1.瀏陽(yáng)市集里醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 瀏陽(yáng)430100；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中西結(jié)合研究所，湖南 長(zhǎng)沙410008）

蛋白質(zhì)組學(xué)研究基因的最終表達(dá)產(chǎn)物是具有活性的蛋白質(zhì)，以蛋白質(zhì)雙向電泳和新型質(zhì)譜分析為技術(shù)平臺(tái)，同條件和狀態(tài)下蛋白質(zhì)組的性質(zhì)和變化規(guī)律，是后基因組時(shí)代的研究重點(diǎn)。目前腦梗死的發(fā)生機(jī)制雖然復(fù)雜，但歸納起來(lái)不外虛（陰虛、氣虛）、火、風(fēng)、痰、瘀幾個(gè)方面。有人從腦梗死患者四診信息和檢測(cè)指標(biāo)的搜集，運(yùn)用聚類(lèi)分析、對(duì)應(yīng)分析、因子分析和結(jié)構(gòu)方程等統(tǒng)計(jì)方法，初步將本病分為風(fēng)瘀證、陰虛證、氣虛證、火熱證、痰濕證，然而腦梗死證的本質(zhì)研究還沒(méi)有確切結(jié)論。為進(jìn)一步探討腦梗死各種證型之間關(guān)聯(lián)因素，本實(shí)驗(yàn)采用雙向凝膠電泳分離腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證血清，用PD-QUES 分析2D電泳圖譜，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS) 分析獲取肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），Mascot 軟件檢索SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度比較腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證，從更深層次闡明腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證，研究其蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，闡明腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證的病理生理機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

實(shí)驗(yàn)組：腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證患者為2010年2月至2011年10月瀏陽(yáng)市集里醫(yī)院門(mén)診及住院病人。其診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第六版《神經(jīng)內(nèi)科學(xué)》腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證辨證標(biāo)準(zhǔn)參照中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中西結(jié)合研究所制定的標(biāo)準(zhǔn)[2]：肝陽(yáng)化風(fēng)證 眩暈欲倒，肢麻，手足震顫，語(yǔ)言謇澀，半身不遂。陰虛風(fēng)動(dòng)證 手足蠕動(dòng)或筋肉掣動(dòng)，午后潮熱，盜汗，口干咽燥，形體消瘦。共收集病例32 例，其中男性17 例，女性15 例；年齡41～68 歲，平均年齡（52.7±8.1）歲。對(duì)照組：10 例均為健康者，其中男性6 例，女性4 例；年齡40～64 歲，平均年齡（52.7±6.9）歲。全部病例均排除心、肝、腎等功能不全者，有活動(dòng)性胃腸病變者，血液及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者，過(guò)敏體質(zhì)者，孕期或哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 試劑 二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、雙向凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲-酮-胰蛋白酶、碳酸氫銨、三氟乙酸、乙睛和基質(zhì)а-氰基-4-羥基肉桂酸均為Sigma 公司產(chǎn)品，固相pH 梯度干膠條，IPG 緩沖液、兩性電解質(zhì)、覆蓋液、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘 氨 酸、Tris、CHAPS、SDS 均 為 Amersham Biosciences 產(chǎn)品，甲醛和EDTA 二鈉，考馬斯亮藍(lán)G250為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 儀器 IPGphor 等電聚焦儀、Ettan DALT 垂直電泳槽、PD-QUEST 凝膠圖像分析軟件、Imagescanner掃描儀、Labscan 掃描控制和分析前處理軟件。

1.2.3 標(biāo)本采集及處理 取腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證患者及正常人外周靜脈血3～4 mL 于非抗凝的滅菌離心管中，室溫下靜置1 h，離心10 min（3 000 r/min）后，吸取上清液。

1.2.4 血清蛋白的提取 按Sigma 公司ProteoPrep Blue Albumin Depletion Kit 去除白蛋白與IgG，BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)濃度，其余上清分裝置-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 雙向凝膠電泳 （1） 第一向等電聚焦（IEF）：IPG-DALT 主要參照IPGphor 等電聚焦系統(tǒng)使用指南進(jìn)行血清蛋白與水化液。30 V 水化14 h 后依次經(jīng)100 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 8.5 h 進(jìn)行等電聚焦，水化和聚焦均在20 ℃進(jìn)行，總電壓時(shí)間積為68 000 Vh；（2）平衡：等電聚焦后，迅速取出IPG 膠條分別于10 mL 平衡A 液和10 mL 平衡B 液中各平衡15 min；（3） 第二向垂直SDS-PAGE 電泳：將平衡后的IPG 膠條轉(zhuǎn)移至12%的0.75 mm 厚的凝膠上端，使IPG 膠條與凝膠上端緊密貼合，在一端加入低分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，排盡氣泡后，用含痕量溴酚蘭的0.8%的瓊脂糖封頂。電泳條件為：2.5 W/膠電泳30 min 后以15 W/膠恒功率電泳，直至溴酚藍(lán)指示線到達(dá)凝膠底邊處停止電泳。

1.2.6 考馬斯亮藍(lán)染液染色 考馬斯亮藍(lán)染液置搖床上染色12 h。染色后的膠條用20%乙醇脫色20～30 min，然后用DDW 水洗2～3 次，每次5～10 min，直至背景清晰為止。

1.2.7 圖像分析 Imagescanner 掃描儀掃描考染的凝膠，PD-QUES 圖像分析軟件依次進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)、背景消減，建立平均凝膠，匹配、量化獲取斑點(diǎn)的相關(guān)信息等分析。斑點(diǎn)位置的重復(fù)性按Gorbett 的方法[4]進(jìn)行計(jì)算。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS for Windows 11.0 軟件和Excel 上進(jìn)行.

1.2.8 質(zhì)譜分析 隨機(jī)選取并切割分辨較好的蛋白質(zhì)點(diǎn)于1.5 mL Eppendorf 管中，按本實(shí)驗(yàn)室以往方法［3]稍作修改，50%乙腈和50 mmol 碳酸氫氨脫色30 min，水洗數(shù)遍直至藍(lán)色消失，乙氰脫水冷凍抽干，5 μL TPCK-Trypsin 冰上吸脹60 min 后37 ℃酶解13 h，覆蓋30 μL 萃取液萃取60 min，重復(fù)萃取過(guò)程2 次，將2 次萃取液收集于0.5 mL Eppendorf 管中，冷凍抽干儀濃縮樣品至總體積5 μL 左右。取0.5 μL 樣品與等體積飽和基質(zhì)液CCA 混合，點(diǎn)樣于不銹鋼板上，空氣中干燥。制備好的樣品在Voyager-DE STR MALDI-TOF-MS 儀上分析，采用反射模式，正離子譜測(cè)定，離子源加速電壓為20 000 V，反 射 電 壓 比 為1.12，N2 激 光 波 長(zhǎng)337 nm，脈沖寬度為3 ns，離子延遲提取100 ns，真空度4×10-7Torr，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50 次，質(zhì)譜使用ATCH 作為外部標(biāo)準(zhǔn)校正，獲得肽質(zhì)量指紋圖。

1.2.9 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 采用Matrix Science 的Mascot軟件搜索SWISS-PROT 數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索條件為：肽片斷質(zhì)量最大誤差控制在0.5 Da，酶解片斷不完全選擇為1 個(gè)，物種來(lái)源為人類(lèi)，離子選擇 [M+H]+和monoisotopic，固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化，可變修飾為蛋氨酸氧化，Mascot 配套軟件 Mascot Distiller 過(guò)濾肽質(zhì)量峰。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證血清差異蛋白質(zhì)點(diǎn)比較

應(yīng)用PDQuest 2DE 軟件分析雙向電泳圖，共檢測(cè)到29 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，雙向電泳圖重復(fù)性好。腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證組與陰虛風(fēng)動(dòng)證組血清差異蛋白質(zhì)點(diǎn)見(jiàn)表1，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.85，P＜0.05）。腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證其典型的雙向電泳圖見(jiàn)圖1，腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證血清雙向凝膠電泳第1、2 蛋白質(zhì)點(diǎn)差異點(diǎn)見(jiàn)圖2。

表1 腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證血清差異蛋白質(zhì)點(diǎn)

圖1 腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證典型的雙向電泳圖(考染)

圖2 腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證血清雙向凝膠電泳第1、2 蛋白質(zhì)點(diǎn)差異點(diǎn)電泳圖

2.2 腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證MALDITOF-MS 肽質(zhì)量指紋圖分析

從腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證正常人匹配的點(diǎn)中選擇29 個(gè)分辨清楚的蛋白質(zhì)點(diǎn)，做好標(biāo)記，進(jìn)行MALDI-TOF-MS 分析，并以ACTH 為外標(biāo)進(jìn)行校正，共獲得了87 張肽質(zhì)量指紋圖。1 號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖見(jiàn)圖3。

圖3 腦梗死肝陽(yáng)上亢蛋白質(zhì)1 號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖

2.3 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果

用Matrix Science 的Mascot 軟件搜索SWISSPROT 數(shù)據(jù)庫(kù)圖，結(jié)果示腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證N 甲基-天冬氨酸蛋白受體、c 反應(yīng)蛋白、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清銅藍(lán)蛋白、S100β 蛋白(S100β)、細(xì)胞骨架蛋白等表達(dá)上調(diào)。腦梗死陰虛風(fēng)動(dòng)證糖蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、蛋白S、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白等表達(dá)上調(diào)。腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證主要差異蛋白質(zhì)點(diǎn)見(jiàn)表2。

表2 腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證主要差異蛋白質(zhì)點(diǎn)

3 討論

既往研究認(rèn)為急性腦梗死患者的發(fā)病機(jī)制之一是動(dòng)脈內(nèi)膜功能紊亂，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化因子增高，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，造成血管內(nèi)膜受損。C 反應(yīng)蛋白與單核細(xì)胞結(jié)合誘導(dǎo)組織因子表達(dá)，使促凝血過(guò)程發(fā)生，有報(bào)道CRP 水平升高者發(fā)生ACI 的幾率是正常者的2倍［4］。CRP 同時(shí)在腦梗死病理過(guò)程中扮演重要角色，腦卒中后2 h 細(xì)胞啟動(dòng)炎性介質(zhì)反應(yīng)，從而引起CRP 水平表達(dá)增高，使病理血管損傷反應(yīng)增大，加重腦梗死的發(fā)展。腦梗死基本病因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈粥樣硬化往往導(dǎo)致頸內(nèi)動(dòng)脈與椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)的狹窄和血栓形成，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成更是腦梗死的殺手锏。血管細(xì)胞黏附分子是早期巨噬細(xì)胞黏附趨化反應(yīng)的主要參與因素之一，抗炎因素和致炎因素的失平衡狀態(tài)最終導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定。基質(zhì)金屬蛋白酶-9 是一組鋅、鈣離子依賴性蛋白水解酶家族，是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解和重構(gòu)的重要介質(zhì)，存在于正常人體，參與多種生理和病理過(guò)程，有助于創(chuàng)傷愈合和血管生成[5]。腦梗死缺血血管痙攣往往與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子緊密關(guān)聯(lián)。

證候是在致病因素作用下，機(jī)體內(nèi)外環(huán)境各系統(tǒng)之間相互關(guān)系發(fā)生紊亂所產(chǎn)生的綜合反應(yīng)，是反映疾病處于某一階段病因、病性、病位、病勢(shì)等病理要素的綜合性診斷概念。腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證血清差異蛋白質(zhì)點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證為何蛋白質(zhì)差異點(diǎn)有如此明顯區(qū)別，可能與如下原因相關(guān)：腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證為肝陽(yáng)亢逆無(wú)制而表現(xiàn)動(dòng)風(fēng)的證候，可能與細(xì)胞炎癥介質(zhì)反應(yīng)緊密關(guān)聯(lián)，其中與炎性介質(zhì)反應(yīng)引起CRP 高水平表達(dá)、血管細(xì)胞黏附分子參與啟動(dòng)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有關(guān)聯(lián)。陰虛風(fēng)動(dòng)證是陰液虧虛，筋脈失于濡養(yǎng)引動(dòng)肝風(fēng)的證候，腦梗死陰虛風(fēng)動(dòng)證與動(dòng)脈粥樣硬化和炎性介質(zhì)反應(yīng)關(guān)聯(lián)因素不大，病因很難確認(rèn)，與基質(zhì)金屬蛋白酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等引起的血管痙攣緊密關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)證明了腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證其蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)有顯著差異，蛋白質(zhì)組學(xué)能對(duì)各自證型有典型代表意義。

盡管通過(guò)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，我們所獲得的還只是部分蛋白質(zhì)粗略的功能信息，但是，本實(shí)驗(yàn)為一步構(gòu)建腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)提供了有意義的資料，為二者臨床與病理進(jìn)行了深入分析，為尋找可以用于腦梗死肝陽(yáng)化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動(dòng)證診斷與治療的相關(guān)蛋白質(zhì)提供了線索。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍有待進(jìn)一部驗(yàn)證。

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