惠 明 李莉媛， 張曉琳 韓 偉 郭偉群

7株雞源腸球菌的分離、鑒定及益生性能比較

惠 明1李莉媛1，2張曉琳2韓 偉2郭偉群2

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院1，鄭州 450000)
(國家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)

對從健康6日齡AA肉仔雞腸道中分離出的7株腸球菌進(jìn)行了體外生物學(xué)特性研究。利用腸球菌選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離，采用16SrRNA和Biolog兩種方法進(jìn)行菌種鑒定，并測定其生長、產(chǎn)乳酸、抑制病原菌、耐人工胃腸液等益生性能指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，從小雞腸道中分離得到的7株菌，經(jīng)鑒定為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)或屎腸球菌(Enterococcus faecium)，通過對7株菌的益生性能進(jìn)行綜合評價比較后，篩得菌株Enterococcus faecium GJ01013，其具有生長速度快(代時 ＜30 min)、延滯期短、產(chǎn)L－ 乳酸能力強(qiáng)(達(dá)6．5 g/L)、對致病型大腸桿菌K88/K99、多殺性巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用(最大抑菌圈直徑可達(dá)21．5 mm)、人工胃腸液中存活率高(最高達(dá)93．5%)等優(yōu)良特點，為飼用益生菌產(chǎn)品開發(fā)提供了菌種來源。

益生菌腸球菌 鑒定 體外評價

益生菌制劑作為飼用抗生素替代產(chǎn)品之一，越來越受到人們的重視。例如，益生菌能夠調(diào)節(jié)動物消化道的微生態(tài)區(qū)系平衡，通過補(bǔ)給優(yōu)勢菌株，在動物腸道幫助建立和維持正常的腸道優(yōu)勢種群，可有效排除或控制潛在的病原菌;促進(jìn)動物生長，能夠合成維生素K、B族維生素、β－胡蘿卜素等可被動物直接吸收利用，從而加強(qiáng)動物的營養(yǎng)代謝;可產(chǎn)生非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，產(chǎn)生干擾素，或作為免疫復(fù)活劑，刺激胃腸非特異性局部免疫，從而提高免疫球蛋白濃度和巨噬細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抗病力等［1－4］。

腸球菌為消化道內(nèi)正常存在的一類微生物，在腸黏膜具有較強(qiáng)的耐受和定植能力，并且是一種兼性厭氧的乳酸菌，與厭氧、培養(yǎng)保存條件苛刻的雙歧桿菌相比，更適合于生產(chǎn)和應(yīng)用［5］。1989年美國FDA就公布它為可直接用于動物的菌種之一。我國農(nóng)業(yè)部第1126號公告公布允許使用的飼料添加劑品種目錄(2008)中，微生物飼料添加劑有16種，屎腸球菌(Enterococcus faecium)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和乳酸腸球菌(Lactococcus lactis)也都包括在內(nèi)［6］。一般認(rèn)為，優(yōu)良的益生菌菌株應(yīng)來自動物體內(nèi)，能夠耐受胃腸道內(nèi)環(huán)境、生長快、能產(chǎn)乳酸、抑制病原菌生長及能夠在腸道內(nèi)定植等［7］。本試驗從6日齡健康A(chǔ)A肉仔雞腸道中分離出7株腸球菌，從益生學(xué)角度出發(fā)評價其體外生物學(xué)性能，最后篩選出綜合性能較好的一株菌，為開發(fā)飼用益生菌產(chǎn)品提供菌株來源。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 試驗菌種

大腸桿菌K88(Escherichia coli K88)、大腸桿菌K99(Escherichia coli K99)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach):中國獸醫(yī)菌種保藏管理中心(CVCC);對照菌糞腸球菌CGMCC1．0130:中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1．1．2 主要儀器

HVE－50高壓蒸汽滅菌鍋:日本Hirayama公司;YS100雙目生物顯微鏡:日本Nikon公司;Microstation自動微生物鑒定儀:美國Biolog公司;SWCJX－2F凈化工作室:蘇州匯通空調(diào)凈化工程有限公司;SBA－40C生物傳感儀:山東省科學(xué)院生物研究所;Mastercycler普通PCR儀:德國艾本德股份公司;DYY－6C電泳儀:北京市六一儀器廠。

1．1．3 培養(yǎng)基配方

腸球菌選擇性培養(yǎng)基(EC):蛋白胨2 g，酵母浸膏0．5 g，葡萄糖0．2 g，Na2HPO40．4 g，K2HPO40．4 g，瓊脂2 g，雙蒸水100 mL，pH 7．4，冷至45～50℃，加入NaN3至終濃度為0．4 mg/mL，2，3，5－氯化三苯四氮唑(TTC)至0．1 mg/mL。

MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母浸膏5 g，K2HPO42 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，Tween－80 1 mL，MgSO4·7H2O 0．58 g，MnSO4·H2O 0．25 g，1 000 mL蒸餾水，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 7．0，115℃滅菌30 min。MRS固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1．5%的瓊脂。

LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 10 g，1 000 mL蒸餾水，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 7．0，121℃滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1．5%的瓊脂。

1．2 試驗方法

1．2．1 腸球菌的分離［8］

采集健康6日齡AA肉仔雞空腸、回腸、盲腸腸道內(nèi)容物，用滅菌的載玻片刮取黏液，用滅菌生理鹽水稀釋到10－4，取0．1 mL涂布于腸球菌選擇性培養(yǎng)基(EC)平板上，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑取有藍(lán)黑色環(huán)帶，表面光滑凸起，周邊整齊，直徑1．0～1．5 mm的菌落，轉(zhuǎn)接于EC基礎(chǔ)斜面，涂片，革蘭氏染色鏡檢，篩選G+，呈圓形或卵圓形，單個、成對或短鏈狀排列的菌株，20%甘油保種，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 Biolog菌種鑒定

按照Biolog GP2微生物鑒定儀使用手冊和Biolog微生物自動分析系統(tǒng)－細(xì)菌鑒定操作規(guī)程的研究所述的操作步驟進(jìn)行Biolog菌種鑒定［9－10］。

1．2．3 16SrRNA鑒定

1．2．3．1 總DNA的提取

用Progema Wizard Genomic DNA提取試劑盒提取菌株總DNA。

1．2．3．2 PCR擴(kuò)增及測序［11］

正向引物:5'－GAGTTTGAT CCT GGC TCAGGA CGA－3'，反 向 引物:5'－CGC ACC TTC CGATAC GGG CTA CCT－3'由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系:正向引物(24 bp)1μL，反向引物(24 bp)1μL，10×Buffer 5μL，Mg2+4μL，dNTP 2μL，Ex-Taq酶1μL，模板3μL，ddH2O 35μL。反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃，5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán);72℃延伸5 min。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入2μL溴酚藍(lán)染色液，混勻加在1%瓊脂糖凝膠(含goldview 2．5μL)，1×TAE緩沖液中恒壓80 V電泳45 min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物直接送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1．2．4 生長曲線與乳酸代謝曲線的測定［12］

將甘油低溫保存的各菌株按1%接入到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h作為種子。將1 mL種子液分別加入100 mL的MRS培養(yǎng)基中，在37℃，150 r/min培養(yǎng)18 h，每2 h取樣一次，以MRS液為對照，對所取樣品分別測定OD600，每個處理3個重復(fù)，記錄數(shù)據(jù)繪制生長曲線。同時使用生物傳感儀分別測定各時間點菌體培養(yǎng)液中乳酸產(chǎn)量，重復(fù)3次，記錄數(shù)據(jù)繪制乳酸代謝曲線。

1．2．5 抑菌活性的測定

采用牛津杯法測定各菌株對致病型大腸桿菌K88/K99、多殺性巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的抑制能力［13］。

1．2．6 人工胃、腸液耐受性測定

人工胃液配方:取100 g/L的鹽酸16．4 mL加蒸餾水稀釋，使pH值分別為1．5、2．5和3．5，然后按照每100 mL加1 g的量加入胃蛋白酶，充分溶解，微孔濾膜(0．22μm)除菌，待用［14］。

人工腸液配方:取KH2PO46．8 g，加蒸餾水500 mL溶解，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4 g/L NaOH溶液調(diào)至pH 6．8，加水稀釋至1 000 mL，按照每100 mL加1 g的量加入胃蛋白酶，充分溶解，微孔濾膜除菌(0．22μm)，待用［15］。

將活化后的菌株分別以10%接種量接入上述人工胃、腸液中，每個處理設(shè)3個重復(fù)，37℃恒溫培養(yǎng)1．5 h，利用平板菌落計數(shù)法測定菌數(shù)并計算存活率。

1．2．7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin8．0制圖，SPSS16．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株鑒定

2．1．1 形態(tài)觀察

經(jīng)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察，分離的7株菌均符合腸球菌的形態(tài)特征。在腸球菌選擇性培養(yǎng)基上菌落周圍有藍(lán)黑色環(huán)帶，表面光滑凸起，周邊整齊，單菌落直徑1．0～2．0 mm，革蘭氏染色為G+，圓形或卵圓形，成對或短鏈狀排列，分別編號為:GJ01007、GJ01010、GJ01011、GJ01012、GJ01013、GJ01014和GJ01015。圖1為GJ01013的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)圖。

圖1 GJ01013菌落形態(tài)及顯微形態(tài)

2．1．2 Biolog鑒定結(jié)果

Biolog微生物自動分析系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌對糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進(jìn)行鑒定［16］。7株菌鑒定結(jié)果均為種名，如表1所示。

表1 Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果

2．1．3 16SrRNA鑒定結(jié)果

16SrRNA基因含有高度保守的基因片段，大約1．5 Kb，由圖2可以看出，7株菌在1 000～2 000 bp間均有明顯的條帶，1．5 kb左右，這表明PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了預(yù)期長度的16S rDNA序列。將測序得到的結(jié)果應(yīng)用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較，得出GJ01007、GJ01010、GJ01011、GJ01012和GJ01015與糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的同源性為99%，GJ01013和GJ01014與屎腸球菌(Enterococcus faecium)的同源性為100%。

圖2 16SrDNA基因PCR反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2．2 菌株的生長、產(chǎn)乳酸性能

腸球菌生長速度快、代時短和產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)是其作為益生菌制劑的一個很大優(yōu)勢。如圖3、圖4所示，7株菌在1～2 h就進(jìn)入了對數(shù)增長期，并持續(xù)到8 h，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。隨著菌體的生長，乳酸產(chǎn)量也逐漸升高，在14 h后基本趨于穩(wěn)定。通過與對照菌株Ef1．0130和其他菌株相比較，GJ01013代時＜30 min、延滯期短、最大生長比速率為0．35 h－1、穩(wěn)定期菌數(shù)高，且乳酸最終產(chǎn)量可達(dá)6．5 g/L。

圖3 不同菌株生長曲線圖

圖4 不同菌株乳酸產(chǎn)量曲線圖

2．3 抑菌能力

致病型大腸桿菌K88/K99、多殺性巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌是較為常見的動物致病菌，對致病菌的抑菌活性是腸球菌作為益生菌制劑的一個必要前提［17］。由圖5可知，這7株菌對以上5株常見致病菌均有一定的抑制能力，相比對照菌Ef1．0130和其他菌株，GJ01013對5株致病菌均有較強(qiáng)的抑制能力，抑菌圈直徑均在15 mm以上，對大腸桿菌K88的抑菌圈直徑可達(dá)21．5 mm。

圖5 7株腸球菌對5株致病菌的抑菌活性比較

2．4 人工胃、腸液耐受性

胃液pH的大小根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)的不同而波動，通常在pH 3．0左右，這種酸性環(huán)境可以激活胃液中的胃蛋白酶原，從而殺死胃內(nèi)的細(xì)菌，食物通過胃的時間相對較短，一般為1～2 h。小腸液的pH約為7．6，其中除了大量的水分外，還有各種酶、膽汁鹽等多種成分，對腸內(nèi)菌群有著多方面的影響，食物通過動物小腸的平均時間約為1．5 h。因此保持一定數(shù)量的活菌數(shù)是其發(fā)揮作用的先決條件。

圖6 7株腸球菌對人工胃、腸液耐受性

由圖6可以看出7株菌對人工胃液都表現(xiàn)有耐受性，不同pH胃液的存活率分別在20%、50%和70%以上。對人工腸液也有一定的耐受性，存活率均在60%以上。綜合比較，菌株GJ01013耐胃、腸液能力相對較強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

Biolog自動微生物分析系統(tǒng)與傳統(tǒng)鑒定方法相比，具有快速、便捷、有效的特點，特別是對于沒有目的性的未知微生物，可為鑒定者提供方向性指導(dǎo)。除GJ01012的Biolog鑒定結(jié)果與16SrRNA序列分析結(jié)果不一致外，其余菌株的兩種鑒定方法結(jié)果均一致?？紤]到Biolog自動微生物分析系統(tǒng)在其數(shù)據(jù)比對過程中記入一些非特異性的陽性反應(yīng)，會造成偶然誤差，從而引起個別鑒定結(jié)果的不穩(wěn)定［18］，GJ01012的鑒定結(jié)果暫以16SrRNA序列分析結(jié)果為準(zhǔn)，還有待進(jìn)一步準(zhǔn)確印證。

上述從6日齡肉仔雞腸道中分離得到的7株腸球菌，通過體外益生性能評價后，經(jīng)數(shù)據(jù)綜合分析，與對照菌株和其他菌株相比，篩選出一株Enterococcus faecium GJ01013，具有生長速度快，產(chǎn)L－ 乳酸能力強(qiáng)，能抑制致病型大腸桿菌K88/K99、多殺性巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的生長和耐人工胃腸液等優(yōu)良特性，為新型飼用微生態(tài)制劑的開發(fā)提供菌種來源。

［1］李曉輝．飼用微生物的種類和主要作用［J］．飼料工業(yè)，2002，23(2):30－32

［2］陳才勇，王恬．益生素對動物保健作用的研究進(jìn)展［J］．飼料廣角，2002(16):24－25

［3］Sudo N，Sawanmura a Tanaka K．The requirement of intestinal bacterial flora for the development of a IgE production system fully susceptible to oral tolerance induction［J］．J Immunol，1997，159:1739－1745

［4］張日?。畡游镂改c道菌群與其免疫功能和健康的關(guān)系［J］．飼料廣角．2002(21):17－20

［5］李梅，李衛(wèi)芬，姚江濤．豬源腸球菌的分離及鑒定［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007(3):50－51

［6］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告(第1126號)［J］．獸藥與飼料添加劑，2009，14(1):43－45

［7］Ehrmann MA，Kurzak P，Bauer J，et al．Characterization of lactobacilli towards their use as probiotics adjuncts in poultry［J］．Journal of Applied Microbiology，2002，92:966－975

［8］王婷婷．微囊化屎腸球菌制劑的研究［D］．武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009

［9］程池，楊梅，李金霞，等．Biolog微生物自動分析系統(tǒng)－菌鑒定操作規(guī)程的研究［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32:50－54

［10］Holmes B，Costas M，Ganner M，et al．Evaluation of biolog system for identification of some gram－negative bacteria of clinical importance［J］．Journal of Clinical Microbiol，1994，32(8):1970－1975

［11］Botina SG，Sukhodolets VV．Speciation in bacteria:comparison of the 16S rRNA gene for closely related enterococcus species．Genetika，2006，42:325－330

［12］郭蘊(yùn)劼．益生屎腸球菌的篩選及微囊化特性研究［D］．北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008

［13］劉冬梅，李理，楊曉泉，等．用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力［J］．食品研究與開發(fā)，2006，27:110－111

［14］徐義剛，崔麗春，趙麗麗，等．重組干酪乳桿菌在模擬消化環(huán)境中生存性能的研究［J］．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18:424－426

［15］辛羚，郭本恒，吳正鈞．3株乳桿菌在模擬消化環(huán)境中存活性能的研究［J］．中國乳品工業(yè)，2005(5)．15－16

［16］Holmes B，Costas M，Ganner M，et al．Evaluation of Biolog system for identification of some gram－negative bacteria of clinical importance［J］．Journal of Clinical Microbiol，1994，32(8):1970－1975

［17］王婷婷，李愛科，易建明，等．飼用屎腸球菌的篩選、鑒定及其生物學(xué)特性［J］．中國糧油學(xué)報，2010，25:90－93

［18］杜昕波，趙耘，李偉杰．菌種保藏中的細(xì)菌鑒定方法［J］．中國獸藥雜志，2009，43(3):50－52．

Isolation，Identification and Comparison of Probiotic Characteristics of Seven Kinds of Chicken Enterococcocci

Hui Ming1Li Liyuan1，2Zhang Xiaolin2Han Wei2Guo Weiqun2
(Institute of Biological Engineering，Henan University of Technology1，Zhengzhou 450000)
(Research Institute of State Grain Administration2，Beijing 100037)

This article studies the biological characteristics in vitro of seven enterococcocci which are isolated from the guts of 6－day－old AA broiler chickens．Selective medium is used to isolate enterococcocci and two methods that are 16S rRNA and Biolog are used to identify these strains，and the probiotic characteristics index such as growth，lactic acid production，inhibiting pathogens and tolerance of artificial gastrointestinal fluid are determined．This research finds that the seven strains are either Enterococcus faecalis or Enterococcus faecium．After comparing the performances of probiotics，an excellent strain named Enterococcus faecium GJ01013 can be obtained．It has the following characteristics:faster growth(generation time＜30 min)，shorter lag phase，better capacity of L－lactic acid production(up to 6．5 g/L)，stronger inhibitory of Escherichia coli K88/K99，Pasteurella multocida，Salmonella pullorum and Staphyloccocus aureus Rosenbach(the maximum antibacterial diameter can be up to 21．5 mm)，and higher survival rate of artificial gastrointestinal fluid(the highest survival rate is 93．5%)．Enterococcus faecium GJ01013 shows excellent performance for the exploitation of new feed probiotic products．

probiotics，Enterococcus，identification，in vitro evaluation

Q939．9

A

1003－0174(2012)07－0077－05

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2009GB24490 503)，中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金課題(ZX1005)

2011－10－25

惠明，男，1969年出生，副教授，工業(yè)微生物與發(fā)酵技術(shù)

張曉琳，女，1975年出生，研究員，發(fā)酵生物技術(shù)