王宏魁，李清州，毛 薇

（1.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W校，河南 鄭州450011；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究中心，河南 鄭州450002；3.河南省鄭州市鐵路職業(yè)技術(shù)學院，河南 鄭州450052）

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原，可引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦炎、流產(chǎn)、多發(fā)性漿膜炎和支氣管肺炎，發(fā)病豬群死亡率可達80%。該菌分為35個血清型，其中血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病豬中經(jīng)常流行的血清型，與動物致病性有很大關(guān)系［1］，其中，以2型危害巨大，人可以感染發(fā)病而導致敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和永久性耳聾等［2－5］，甚至引起死亡，引起極大的公共衛(wèi)生關(guān)注。本試驗于2009年7月至2010年1月，在河南省14個地市33個豬場送檢的病豬中無菌采集腭扁桃體樣品83份，進行了豬鏈球菌的檢測及分離鑒定，以期為研制豬鏈球菌新型疫苗和新型檢測方法提供試驗材料。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 2009年7月至2010年1月從河南省不同地市送診的臨床發(fā)病豬體內(nèi)采集腭扁桃體樣品，于－20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 參考菌株和主要試劑 參考菌株豬鏈球菌1型SH28，2型S735由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心范偉興教授惠贈，豬鏈球菌7型、9型菌株由河南農(nóng)業(yè)大學傳染病教研室分離保存。陰性對照菌株馬鏈球菌獸疫亞種（C群，CVCC562），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。DL－2 000DNA Marker、rTaqDNA聚合酶，均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；BactoTMTodd Hewitt Broth（THB），購自 BD 公司；DNA膠回收試劑盒，購自百泰克生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 豬鏈球菌的分離鑒定 用無菌接種環(huán)挑取扁桃體樣品劃線接種于綿羊血瓊脂平板，37℃溫箱倒置培養(yǎng)16～20h，挑取單個疑似菌落再次劃線接種于血平板進行純化，經(jīng)革蘭染色鏡檢后，挑取單個菌落轉(zhuǎn)接入5mL THB液體培養(yǎng)基（30g／L）中，37℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)16～20h，抽提基因組DNA，進行PCR鑒定。

1.4 引物的設(shè)計與合成 參照Smith等［4］介紹的方法，以 GenBank中收錄的豬鏈球菌1（14）、2（1／2）、7、9型型特異的cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列（序列號分別為：AF155804、EF539837、AF164515、AF155805）為參考，利用Primer 5.0和Oligo 6.0分別設(shè)計4對引物。豬鏈球菌菌種鑒定引物使用Ogi等［6］公布的引物序列。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1 PCR引物

1.5 基因組DNA的提取 取200μL菌液于1.5 mL Eppendorf管中，4℃12 000r／min離心1min。棄上清液，加入1mL TE溶液（10mmol／L Tris－HCl，1mmol／L EDTA，pH 值8.0）懸浮洗滌1次。4℃12 000r／min離心1min。棄上清液，加入100 μL TE溶液，重新懸浮。100℃煮沸5min，冷卻至室溫。12 000r／min離心1min。取上清直接PCR或保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴增 分兩次PCR進行。豬鏈球菌種及其1、2、7型四重PCR擴增反應(yīng)體系：10×Buffer 5μL、MgCl2（25mmol／L）5μL、dNTPs（10mmol／L each）1μL、上下游引物（20μmol／L）gdh與cps7H各1.2μL，cpslI與cps2H各1μL、模板 DNA 2 μL、rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，加 ddH2O至50μL。豬鏈球菌9型單一PCR擴增反應(yīng)體系：10×Buffer 5μL、MgCl2（25mmol／L）5μL、dNTPs（10mmol／L each）1μL、上下游引物（20μmol／L）各1μL、模板DNA 2μL、rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，加ddH2O至50μL。反應(yīng)參數(shù)均為：95℃ 預變性5min；94℃ 變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共40個循環(huán)；72℃終延伸7min。取5μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后在紫外檢測儀下觀察，并用凝膠成像儀拍照保存。抽取部分豬鏈球菌菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物，膠回收純化目的基因片段，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬鏈球菌形態(tài)學觀察 豬鏈球菌均呈針尖狀大小，灰白色或灰色，α溶血（不完全溶血，草綠色溶血環(huán)）、β溶血（透明溶血環(huán)，完全溶血）或γ溶血（不溶血）。其中豬鏈球菌9型PY－2株的形態(tài)灰白色，針尖狀，α溶血。革蘭染色后的豬鏈球菌呈革蘭染色陽性、圓形或卵圓形，成對或長、短鏈狀排列。

2.2 豬鏈球菌PCR鑒定 部分菌株經(jīng)PCR擴增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。分別擴增到了大小約689bp、542bp、441bp和232bp的特異性條帶，與預期擴增結(jié)果相符。

圖1 部分菌株的PCR檢測結(jié)果

2.3 部分菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物的測序驗證 抽取豬鏈球 菌 NYDZ－3、HBQX－6、ZMDSC－2、ZKXH－2、LY－3、AY－1、HBQX－2、HBQX－1、PY－2、PDSWG－1株P(guān)CR擴增產(chǎn)物進行序列測定，所有測序結(jié)果均與預期一致，測序結(jié)果已遞交GenBank，登錄號為GU358478－GU358486和GU223113，從分子水平上驗證了該PCR的準確性。

2.4 分離的菌株總結(jié) 結(jié)果表明，在河南14個地市33個豬場的83份病豬扁桃體樣品中，有68份豬鏈球菌分離陽性，占81.9%，共分離到豬鏈球菌77株，總分離率為92.8%，其中血清2型7株，占8.4%；7型3株，占3.6%；9型4株，占4.8%；其他型63株，占75.9%，未分離到1型。分離的菌株以2型為最多，其次是9型和7型。在河南省14個地市的豬鏈球菌分離株中，有6個地市分離到血清2型，分別是：駐馬店、平頂山、周口、南陽、洛陽、鶴壁。在安陽、鶴壁和濮陽3個地市分離到血清7型。在周口、濮陽、鶴壁和濟源4個地市分離到血清9型。其中在鶴壁市同時分離出血清2、7、9三個型，濮陽市同時分離出血清7型和9型，周口市同時分離出血清2型和9型。

3 討論

豬鏈球菌常存在于健康豬和病豬的扁桃體中。健康豬扁桃體的帶菌率為0%～70%，有的甚至高達100%［6］。李春玲等［7］對廣東省401個屠宰豬的調(diào)查結(jié)果為：SS為154份，占38.4%，其中2型17.2%，9型8.7%，7型和l型分別為2.2%和0.7%。本研究采用PCR法從河南14個地市83只病豬的68只扁桃體內(nèi)共分離檢測到豬鏈球菌77株，陽性檢出率達81.9%，分離率為92.8%，其中2型7株，占8.4%；7型3株，占3.6%；9型4株，占4.8%；其他未知血清型占75.9%，河南省14個地市中有9個地市存在豬鏈球菌血清2、7、9型，并且以2型為最多，存在于其中的6個地市，其次是9型，在4個地市中分離到，然后是7型，存在于3個地市，說明在河南省廣泛存在豬鏈球菌及其主要致病型血清2、7、9型。迄今為止，沒有分離到血清1型，說明河南省可能不存在該血清型。

表2 河南省14個地市病豬腭扁桃體豬鏈球菌的分離情況（份）

河南省豬鏈球菌呈多重感染狀況，多個血清型或與多個病原同時或繼發(fā)感染。在鶴壁某豬場同時分離到了豬鏈球菌血清2、7、9型，但單一血清型分離自不同豬只。在1份病料中同時分離到了豬鏈球菌2型及其他2個未知血清型菌株的樣品有5份，分別自南陽、駐馬店、周口、平頂山、洛陽。在一份病料中同時分離到了豬鏈球菌9型及其他血清型兩個菌株的樣品有2份，分別來自濮陽、周口。說明河南省豬場內(nèi)普遍存在多種血清型豬鏈球菌同時感染的情況。另外，豬鏈球菌與其他病毒和細菌混合感染普遍存在，分離到豬鏈球菌的豬只大多都有HC、PCV、HPS和MPS單一或二重、甚至三重、四重感染。比如：分離到血清2型豬鏈球菌的7只豬都有HC、PCV單個或雙重病毒感染、有1只豬存在MPS感染，有2只豬（2只背景不詳除外）呈現(xiàn)豬鏈球菌病的特征性表現(xiàn)，關(guān)節(jié)腫、皮發(fā)紅、偶有神經(jīng)癥狀。

豬鏈球菌血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病豬中經(jīng)常流行的血清型，與動物致病性有很大關(guān)系［1］。此次分離到的菌株毒力強弱、致病性如何以及在豬只發(fā)病中扮演那種角色，有待于進一步研究。目前，河南省尚缺乏豬鏈球菌致病血清2、7、9型的相關(guān)報道，本試驗闡明了河南省現(xiàn)階段豬鏈球菌不同血清型的流行狀況，為該病的診斷防制以及疫苗的選用提供了新的思路，同時提供了豐富的背景明確的菌株，方便了下一步生產(chǎn)和科研工作的開展。

［1］Wisselink H J，Smith H E，Stockhofe－Zurwieden N，etal.Distribution of capsular types and production of muramidasereleased protein（MRP）and extracellular factor（EF）ofStreptococcussuisstrains isolated from diseased pigs in seven European countries［J］.Vet Microbiol，2000，74：237－248.

［2］Ishigaki K，Nakamura A，Iwabuchi S，etal.A case ofStreptococcussuisendocarditis，probably bovine－transmitted，complicated by pulmonary embolism and spondylitis［J］.Kansenshogaku Zasshi，2009，83（5）：544－548.

［3］Navacharoen N，Chantharochavong V，Hanprasertpong C，etal.Hearing and vestibular loss inStreptococcussuisinfection from swine and traditional raw pork exposure in northern Thailand［J］.J Laryngol Otol，2009，123（8）：857－862.

［4］Haleis A，Alfa M，Gottschalk M，etal.Meningitis caused byStreptococcussuisserotype 14，North America［J］.Emerg Infect Dis，2009，15（2）：350－352.

［5］Hidalgo A，Palacios R，Santos J.Streptococcussuismeningitis in Spain［J］.Enferm Infecc Microbiol Clin，2009，27（3）：195.

［6］Ogi Okwumabua，Michael O′Connor，Eileen Shull.A polymerase chain reaction（PCR）assay specific forStreptococcus suisbased on the gene encoding the glutamate dehydrogenase［J］.FEMS Microbiology Letters，2003，218：79－84.

［7］李春玲，余煒烈，賈愛卿，等.應(yīng)用多重PCR檢測屠宰豬扁桃體中的豬鏈球菌［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2008，30（5）：344－348.