張 表，田興華，羅滿林，趙曉瑜

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642；2.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封475004；3.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定071002）

幾丁質(zhì)是由N－乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）單元通過β－1，4糖苷鍵構(gòu)成的線性同型多聚體，主要分布在甲殼動物、昆蟲的外殼以及真菌的細(xì)胞壁中，年產(chǎn)量100～1 000億t，是自然界僅次于纖維素居第二位的可再生資源［1］。粘質(zhì)沙雷氏菌具有高效分解幾丁質(zhì)的性質(zhì)，是外科手術(shù)中常見的革蘭陰性致病菌［2］。同時，幾丁質(zhì)難溶于水，也不溶于稀酸和稀堿，而其產(chǎn)物幾丁寡糖和單體是重要的免疫增強(qiáng)劑且具有極強(qiáng)的抗菌和抗腫瘤活性［5］。幾丁質(zhì)的難溶性以及粘質(zhì)沙雷氏菌的致病性，長期制約了幾丁質(zhì)的工業(yè)化利用?，F(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，為徹底解決該瓶頸提供了可能［3］。本試驗(yàn)通過粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶的高效表達(dá)、純化及活性分析［4］，為酶法水解幾丁質(zhì)提供了工業(yè)化應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 粘質(zhì)沙雷氏菌ATCC27117、E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pBV221質(zhì)粒由中國科學(xué)院生物物理所靜國忠教授饋贈。

1.2 主要試劑ExTaqDNA聚合酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司。

1.3 目的基因的PCR擴(kuò)增與純化 利用軟件Primer primier 5.0設(shè)計(jì)引物。根據(jù) GenBank L01455，幾丁質(zhì)酶基因chiA開放閱讀框?yàn)? 686 bp。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的 引物如下：SN：5′GGAATTCATGCGCAAATTTAATAAACCG3′；ASN：5′CGGGATCCAACCGATTATTGAACGCCG 3′。 PCR反應(yīng)條件：94℃，4min；循環(huán)參數(shù)：94℃，12s；42℃，10s，72℃，1min；循環(huán)數(shù)40；最后延伸：72℃，10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并回收。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將重組質(zhì)粒pUC－chiA 和載體pBV221同時進(jìn)行EcoRⅠ／BamHⅠ雙酶切，分別回收目的片段，將目的片段和載體片段在T4DNA連接酶的作用下，于12℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100μg／mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆。接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖過夜，提取重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ／BamHⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，并將陽性克隆測序。鑒定為陽性的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.5 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)與條件優(yōu)化 將鑒定的重組菌接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃活化過夜后1%轉(zhuǎn)接于含同樣抗生素的LB液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD值為0.5左右，42℃誘導(dǎo)表達(dá)。分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后3h、5h取菌液，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢查。

1.6 重組蛋白的純化 誘導(dǎo)表達(dá)3h的1L培養(yǎng)液，超聲破碎離心后取上清，超濾濃縮為1／10，80%飽和（NH4）2SO4沉淀該蛋白，沉淀溶解在0.02 mol／L磷酸鹽緩沖液中（pH值6.0）透析過夜。經(jīng)幾丁質(zhì)親和柱層析進(jìn)一步純化該蛋白，將純化產(chǎn)物進(jìn)行10%SDS－PAGE電泳。

1.7 DNS（3，5－二硝基水楊酸）定糖法測定幾丁質(zhì)酶的活性 NAG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：準(zhǔn)確稱取100 mgNAG（預(yù)先在105℃干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，定容到刻度，搖勻，濃度為1mg／mL。取9支25×250mm的試管，分別加入 NAG標(biāo)準(zhǔn)液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL，相對應(yīng)分別加蒸餾水：2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4mL，另外每管加入1.5mL DNS試劑。將各管溶液混合均勻，沸水溫浴5min，立即冷卻至室溫，再向每管加21.5 mL蒸餾水，搖勻，于520nm波長下測OD值。表達(dá)產(chǎn)物活性測定如下：取20mL 42℃誘導(dǎo)表達(dá)3h的培養(yǎng)液，80Hz，20s／次超聲破碎20次，10 000r／min離心1min，取上清備用，2mL上清和23mL 1%幾丁質(zhì)混合液，45℃溫育5h，在520nm波長下測OD值。酶活單位定義：在45℃下每毫升酶液每小時釋放出相當(dāng)于1μg NAG的還原糖所需的酶。

1.8 溶圈法測定幾丁質(zhì)酶的活性 在含1%幾丁質(zhì)的LB固體培養(yǎng)基上，取經(jīng)破壁處理的SM、pBV221／BL21、pBV－chiA5／BL21上清150μL于牛津杯中進(jìn)行溶圈檢測。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)EcoRⅠ／BamHⅠ雙酶切的pBV221（3.7kb）插入chiA基因（1.7kb）后，其大小為5.4kb，重組子應(yīng)比對照遷移率低，挑選5個菌落并提取質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，初步表明所得5個轉(zhuǎn)化子明顯變大，遷移率變小，分別命名為pBV－chiA1－5（圖1）。初步確定為重組子的質(zhì)粒pBV－chiA5，進(jìn)行單酶切、雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)了一條約3.7kb的pBV221載體線性片段和約1.7kb的目的片段（圖2）。酶切片段大小與預(yù)期完全相符，PCR產(chǎn)物大小與雙酶切小片段相同。測序結(jié)果表明，437位堿基由C變?yōu)門。

2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物純化 經(jīng)42℃誘導(dǎo)的重組菌進(jìn)行SDS－PAGE分析，結(jié)果表明，在約58 kDa處有一特異條帶，分子量與預(yù)期大小一致，不同誘導(dǎo)時間對表達(dá)量的影響差別不明顯，最佳誘導(dǎo)時間為3h。用軟件Alpha Imager2200對表達(dá)的蛋白進(jìn)行薄層掃描分析，表明蛋白表達(dá)量約占菌體蛋白的16%，實(shí)現(xiàn)了蛋白在大腸桿菌中的高表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)3h的1L培養(yǎng)液，經(jīng)超聲破碎、80%飽和（NH4）2SO4沉淀、透析、幾丁質(zhì)親和柱層析后10%SDS－PAGE電泳，純化蛋白（圖3）較為理想。

2.3 DNS定糖法結(jié)果 如表1。

根據(jù)表1：重組子△OD值為0.578，SM 的△OD值為0.128，根據(jù)公式Y(jié)＝0.459x＋0.040計(jì)算得相應(yīng)的坐標(biāo)點(diǎn)b（1.172，0.578）和點(diǎn)a（0.192，0.128），由酶活定義可知：酶活力＝NAG含量／（上清體積×?xí)r間），所以重組子的酶活為117.2μ／mL，SM的酶活為19.2μ／mL。

圖3 重組蛋白的SDS－PAGE分析

3.6 溶圈法測幾丁質(zhì)酶活性 SM、pBV221／BL21、pBV－chiA5／BL21經(jīng)破壁處理，取上清150 μL置于含幾丁質(zhì)（1%）的LB固體培養(yǎng)基上的牛津杯中進(jìn)行溶圈試驗(yàn)，3d后溶圈現(xiàn)象明顯可見。重組菌pBV－chiA5／BL21的幾丁質(zhì)酶活性明顯優(yōu)于粘質(zhì)沙雷氏菌SM，對照pBV221／BL21基本沒有幾丁質(zhì)水解活性（圖5）。

3 結(jié)語與討論

3.1 測序結(jié)果表明，克隆的chiA基因序列大小為1 686bp，與GenBank中的L01455相比，437位堿基由C變?yōu)門，表明該基因在利用幾丁質(zhì)作為碳源或氮源的沙雷氏菌屬中較為保守。

3.2 本試驗(yàn)成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pBV－chiA5，該質(zhì)粒在大腸桿菌BL－21中經(jīng)42℃誘導(dǎo)后高效表達(dá)幾丁質(zhì)酶，表達(dá)產(chǎn)物的分子量為58kDa，且主要以可溶性蛋白的形式存在。

表1 不同菌株水解幾丁質(zhì)時吸光度的變化

3.3 本試驗(yàn)采用了飽和（NH4）2SO4沉淀法，幾丁質(zhì)親和柱層析法純化了目的蛋白，保證了幾丁質(zhì)酶的活性，為固定化酶批量生產(chǎn)幾丁寡糖以及免疫佐劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3.4 本試驗(yàn)成功構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶工程菌，其產(chǎn)物活性明顯優(yōu)于粘質(zhì)沙雷氏菌。蛋白的分離純化及活性表達(dá)對生產(chǎn)蛋白結(jié)晶、解析晶體結(jié)構(gòu)、進(jìn)一步了解幾丁質(zhì)酶作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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