李生慶，張西云，李志寧，范玉霞，胡國(guó)元，黃 榮，王亭亭，李積良

（1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧810016；2.青海省祁連縣央隆鄉(xiāng)獸醫(yī)站，青海 祁連810400）

羊腸毒血癥是由D型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染并在羊腸道中大量繁殖產(chǎn)生毒素所引起的一種急性毒血癥。病羊死后腎組織易于軟化，因此，該病又稱“軟腎病”。因該病發(fā)病急，死亡突然，且死亡率高，不易治療，常常給養(yǎng)羊戶帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。

由于引起該病的病原菌為土壤常在菌，芽孢隨飼料和飲水被羊食入，可長(zhǎng)期存在于腸道中，當(dāng)消化道機(jī)能受到損壞時(shí)，病原菌迅速繁殖并產(chǎn)生大量毒素，從而使羊發(fā)病死亡，因此，很難在胃腸道之外的其他臟器內(nèi)分離到病原菌，這給該病的診斷工作增加了難度。鑒于此，根據(jù)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)的α、ε兩種毒素設(shè)計(jì)具有特異性的擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR診斷可在很大程度上降低診斷的難度，并可節(jié)省時(shí)間，提高疫病診斷的精確性。

1 材料

1.1 病料來源 采集的病料為2009年9月青海省祁連縣發(fā)生急性死亡的羊只臟器。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C60－2，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物室；腐敗梭菌FB2010、乳酸大腸桿菌株（XR84）、金黃色葡萄球菌（JP86）為我室分離保存菌株。

1.3 培養(yǎng)基的制備 血液瓊脂、厭氣肝湯兩種培養(yǎng)基均按常規(guī)制備，121℃滅菌40min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試劑TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液、dNTP（10mmol／L）、25mmol／L的 MgCl，均購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；瓊脂糖為Biowest產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 18～22g昆明系小鼠，購自青海省地方病研究所。

2 方法

2.1 病原分離 取病死羊腸道逐段抹片鏡檢，接種疑似菌密度較大腸段的內(nèi)容物于加有新鮮生肝塊的厭氧肉肝湯37℃培養(yǎng)24h，將該培養(yǎng)物接種于鮮血瓊脂平板上，挑取疑似菌落，以得到疑似菌株的純培養(yǎng)物；也可直接用腸內(nèi)容物劃線接種于鮮血瓊脂平板，挑取疑似菌落。

2.2 動(dòng)物試驗(yàn)

2.2.1 腸內(nèi)容物毒素測(cè)定 將病死羊的回腸內(nèi)容物1mL加入9mL生理鹽水中，充分混勻后5 000 r／min離心30min，吸取上清液，用生理鹽水作適當(dāng)稀釋后，在可能的毒力范圍內(nèi)靜脈注射小鼠，每一滴度注射2只，0.2mL／只，觀察記錄小鼠發(fā)病、死亡情況，確定小鼠最小致死量。

2.2.2 分離菌株毒素測(cè)定 取該菌的純培養(yǎng)物，5 000r／min離心30min，吸取上清1mL加含2.5 g／L胰酶的10g／L的碳酸鈉溶液1mL，37℃活化30min后，用生理鹽水倍比稀釋，每一滴度靜脈注射小鼠2只，0.2mL／只，觀察記錄小鼠發(fā)病、死亡情況，確定小鼠最小致死量。

2.3 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR檢測(cè)

2.3.1 DNA模板的制備 將純化的分離待檢菌和標(biāo)準(zhǔn)陽性產(chǎn)氣莢膜梭菌分別接入?yún)捬跞飧螠校?7℃培養(yǎng)24h，取1.5mL培養(yǎng)液于離心管中12 000r／min離心1min，棄去上清液，用1×PBS 200 μL懸浮菌體，13 000r／min離心1min，棄上清后加入200μL1×PBS重懸，混勻后加入蛋白酶K 20 μL，再加200μL CB結(jié)合液，混勻后，70℃水浴放置10min.取出冷卻后加100μL異丙醇，混勻。利用北京博邁德生物科技發(fā)展有限公司研制的組織／細(xì)胞DNA提取試劑盒提取DNA.提取物于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中報(bào)道的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因序列及相關(guān)的參考文獻(xiàn)［1－4］，分別在α毒素和ε毒素的保守區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列如下：

α毒素：上游引物：5′－CACGATGTATCAGAGGGTA－3；下游引物：5′－TAAGTGTCTTTGCTTCCAG－3′

預(yù)期擴(kuò)增片段大?。?02bp

ε毒素：上游引物：5′－GTATCTAATGAAATGTCCA－3′；下游引物：5′－CTTCCACTTACTTGTCCTAC－3′

預(yù)期擴(kuò)增片段大?。?85bp

2.3.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)總體系為25μL：10×Buffer緩沖液 2.5μL，10mmol／L dNTP 1.0μL，上下游引物各0.5μL，模板 DNA 5.0μL，TaqDNA 聚合酶0.5μL，滅菌雙蒸水14 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?6℃預(yù)變性20min，然后94℃變性30s，51℃延伸40s，72℃復(fù)性1min，共循環(huán)30次，最后在72℃延伸10min。

2.3.4 PCR產(chǎn)物電泳 PCR反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳60V，65min，紫外燈下觀察并拍照，分析PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2.4.5 PCR檢測(cè)的特異性試驗(yàn) 分別以乳酸大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗梭菌等作陰性對(duì)照，檢測(cè)PCR反應(yīng)的特異性。

3 結(jié)果

3.1 分離菌的形態(tài)與培養(yǎng)特性 小腸內(nèi)容物涂片、革蘭染色鏡檢，可見大量革蘭陽性兩端鈍圓大桿菌，單個(gè)散在或成對(duì)存在。在厭氧肉肝湯培養(yǎng)24h后涂片見到與小腸內(nèi)容物涂片相同的細(xì)菌；在鮮血瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)，24h開始生長(zhǎng)，48h可見圓形略隆起、灰白色半透明的菌落，菌落周圍有溶血環(huán)，涂片鏡檢可見與腸內(nèi)容物涂片相同的細(xì)菌。

3.2 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 腸內(nèi)容物離心上清注射小鼠后可見興奮、轉(zhuǎn)圈、翻滾等癥狀，分別于4～22min內(nèi)死亡。測(cè)得其小鼠最小致死量為200～400 MLD／mL；分離菌培養(yǎng)物的最小致死量為200～1 600MLD／mL。

3.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用合成的2種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)菌株C 602和分離菌株都擴(kuò)增出大小為202bp的α毒素及585bp的ε毒素的目的條帶，結(jié)果如圖1。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株P(guān)CR擴(kuò)增圖

3.5 特異性試驗(yàn) 在相同條件下，只有標(biāo)準(zhǔn)菌株和兩株分離菌擴(kuò)增出大小202bp的α毒素及585bp的ε毒素相應(yīng)條帶，其他腐敗梭菌、乳酸大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均未擴(kuò)增出上述條帶，表明試驗(yàn)結(jié)果具有好的特異性。結(jié)果如圖2。

圖2 特異性擴(kuò)增結(jié)果

4 討論

長(zhǎng)期以來，主要采用動(dòng)物毒素中和試驗(yàn)來鑒別產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌型，操作起來比較繁瑣，而且有諸多不定的影響因素，容易造成誤差。本試驗(yàn)采用的PCR方法則可直接檢測(cè)毒素的基因，從而不依賴于該菌是否產(chǎn)生了腸毒素。結(jié)果表明，PCR診斷方法快速、準(zhǔn)確，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確率和敏感性，加強(qiáng)了時(shí)效性，取得了良好的診斷效果。為疾病的快速診斷，流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)依據(jù)，為建立多重PCR診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

［1］龔玉梅，Pat Blackall，陳卓明，等.產(chǎn)氣夾膜梭菌型特異性多重PCR 的研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2004，38（2）：22－25.

［2］文其乙，劉秀梵.多重PCR方法快速檢測(cè)糞樣中產(chǎn)氣夾膜梭菌［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（1）：48－51.

［3］Augustynowicz E，Gzyl A，Slusarczyk J.Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens with a duplex PCR［J］.Diagnostic Microbiology.2002：169－172.