王 亮，孫 然，張亞芹，叢憲玲＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春）

皮膚鱗癌（Skin squamous cell carcinoma）是發(fā)病率較高的皮膚惡性腫瘤。皮膚鱗癌在皮膚惡性腫瘤中占有較大比例，一般為80%至90%［1］，其發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)，在老年人中尤其明顯。最新的研究表明，人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA的甲基化異常修飾有關(guān)，基因的甲基化異?？梢韵扔谀[瘤的發(fā)生而存在，因此對(duì)人體腫瘤易感基因進(jìn)行早期的甲基化狀態(tài)檢測(cè)，可以有效地預(yù)防惡性腫瘤的發(fā)生。此外，DNA甲基化檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)還在于取材不僅可以用于腫瘤組織本身，也可以應(yīng)用于血清等體液組織［2－3］，具有簡(jiǎn)便通用的操作特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)甲基化特異性PCR（MSP），對(duì)抑癌基因p14ARF、E－cad及原癌基因FOS、JUN啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)進(jìn)行定性的檢測(cè)，以明確兩種與鱗癌有關(guān)的抑癌基因和原癌基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化變化，進(jìn)而深入的研究皮膚鱗癌的產(chǎn)生機(jī)理并為其早期診斷開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均來(lái)自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院組織標(biāo)本庫(kù)2009年11月－2011年11月收集的住院患者的皮膚組織，其中皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本30例，男性17例，女性13例，年齡27～75歲，平均年齡61歲；正常皮膚組織標(biāo)本20例，男性6例，女性14例，年齡14～56歲，平均年齡24.3歲。所有標(biāo)本取材均具備知情同意書，經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批并經(jīng)病理組織形態(tài)學(xué)檢查確認(rèn)。

1.2 組織DNA的抽提 采用 Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega公司）試劑盒，按照說(shuō)明書抽提DNA。

1.3 對(duì)上述提取的DNA進(jìn)行MSP實(shí)驗(yàn)

1.3.1 DNA的亞硫酸鹽修飾 首先采用基因組DNA 修飾試劑盒（EZ－DNA Methylation Gold Kit公司）對(duì)組織DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，具體過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

1.3.2 原癌基因引物設(shè)計(jì) 通過(guò)UCSC網(wǎng)站對(duì)FOS、JUN基因進(jìn)行序列檢測(cè)，采用Methprimer網(wǎng)站軟件程序?qū)υ┗騀OS、JUN的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行甲基化引物的設(shè)計(jì)。（具體序列見表1）。

表1 FOS、JUN基因MSP引物序列

1.3.3 PCR擴(kuò)增 （1）以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為模板，利用甲基化和非甲基化特異性引物通過(guò)熱啟動(dòng)PCR（Bio－Rad Mycycler PCR）擴(kuò)增基因啟動(dòng)子區(qū)片段，反應(yīng)總體系25μl，體系中含有亞硫酸鹽修飾后的模板DNA 2μl；2×GC BufferⅠ2.5μl，20 μmol／L引物各0.5μl（原癌基因引物為本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成，見表1），LA Taq Hot Start酶0.25μl，dNTP 4.0μl，滅菌雙蒸水5.25μl。

（2）PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s、60℃退火30s（p14ARF）［57℃30s（E－cad）；58℃30s（FOS）；55℃30s（JUN）］、72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)；最后在72℃條件下延伸7min。

（3）取PCR產(chǎn)物10μl上樣，在3.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，通過(guò)EB染色的凝膠 在UVI－FIRE－READER凝膠成像系統(tǒng)中顯像。抑癌基因p14ARF、E－cad以甲基化引物出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陽(yáng)性（M），以非甲基化引物出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陰性（U）；原癌基因FOS、JUN以非甲基化引物出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陽(yáng)性（U），以甲基化引物出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陰性（M）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

30例皮膚鱗癌組織中p14ARF、E－cad基因高甲基化分別為18例（60.0%）和11例（37.6%），而20例正常組織分別為1例（5.0%）和2例（10.0%）；30例皮膚鱗癌FOS、JUN基因非甲基化分別為22例（73.3%）和25例（83.3%），20例正常組織非甲基化分別只有6例（30.0%）和1例（5%）。（表2）。皮膚鱗癌患者抑癌基因p14ARF和E－cad兩個(gè)基因啟動(dòng)子CpG島可見明顯甲基化，原癌基因FOS、JUN啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化率很低，這些對(duì)于皮膚鱗癌診斷及判斷預(yù)后有重大意義。

表2 p14ARF、E－cad、FOS和JUN基因 MSP結(jié)果分析

3 討論

皮膚及其他系統(tǒng)腫瘤中抑癌、原癌基因啟動(dòng)子區(qū)存在異常甲基化現(xiàn)象。由于CpG島的局部異常甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測(cè)［4］。

p14ARF屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白基因家族，其產(chǎn)物P14蛋白是通過(guò)Rb和P53基因途徑抑制組織細(xì)胞從Gl期向S期過(guò)渡的細(xì)胞周期復(fù)性調(diào)節(jié)因子，在抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。據(jù)報(bào)道，該基因失活與多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，如膀胱癌、口腔鱗癌、結(jié)腸癌等［5，6］。此外有研究表明該基因失活可以與EB病毒感染協(xié)同作用，進(jìn)一步促使胃腸道腫瘤的發(fā)生［7］。E－cad基因是細(xì)胞粘附素家族中的成員，其表達(dá)產(chǎn)物可以維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，使上皮細(xì)胞之間連接緊密，細(xì)胞不易脫落。該基因失活會(huì)促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移。子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)E－cad基因表達(dá)減低后，5年生存率會(huì)受到明顯的影響［8］。

圖1 抑癌基因p14ARF、E－cad及原癌基因FOS、JUN甲基化狀態(tài)圖

FOS、JUN基因編碼的是核內(nèi)特異性轉(zhuǎn)錄因子，這兩種基因受RAS通路介導(dǎo)，與腫瘤的產(chǎn)生關(guān)系密切。近些年的研究表明，F(xiàn)OS、JUN兩種基因活化在鱗癌的生成中扮演者重要的角色，歸屬于原癌基因的范疇。通過(guò)對(duì)小鼠子宮腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS基因第4外顯子低甲基化導(dǎo)致其過(guò)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)子宮鱗癌的發(fā)生［9］。在口腔鱗癌和皮膚鱗癌的患者中，JUN 基因的高表達(dá)現(xiàn)象更為明顯［9，10］。

我們的結(jié)果顯示，皮膚鱗癌組織中存在FOS、JUN兩種原癌基因的低甲基化狀態(tài)。此兩種基因的低甲基化與其活化可能存在一定的聯(lián)系。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因協(xié)同作用的結(jié)果，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)抑癌基因p14ARF、E－cad的高甲基化和原癌基因FOS、JUN的低甲基化協(xié)同作用，共同導(dǎo)致皮膚鱗癌的發(fā)生。我們進(jìn)一步推測(cè)，抑癌基因的高甲基化導(dǎo)致癌前病變的發(fā)生，而原癌基因低甲基化最終促使腫瘤的生成。這也提示我們上述4種基因片斷可結(jié)合在一起作為皮膚鱗癌診斷的標(biāo)志。

綜上所述，p14ARF、E－cad、FOS、JUN 基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化與皮膚鱗癌的發(fā)生有一定的聯(lián)系。4種基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)可以應(yīng)用于皮膚鱗癌的診斷及預(yù)后判斷，然而抑癌基因高甲基化與原癌基因低甲基化之間相互協(xié)同機(jī)制等若干問(wèn)題，仍需要擴(kuò)大組織樣本量，并通過(guò)周密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行下一步的研究。

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