梁國威，邵冬華，曹清蕓，王樹琴，王新華，徐雪松

（1.航天中心醫(yī)院 檢驗科，北京100049；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033）

2005年多個研究組同時發(fā)現(xiàn)JAK2V617F（JAK2蛋白酪氨酸激酶基因）第1849位點突變（G＞T）與骨髓增殖性疾?。∕PDs）有關(guān)，該突變可明顯導(dǎo)致真性紅細(xì)胞增多癥（PV）、特發(fā)性血小板增多癥（ET）和骨髓纖維化（IMF）的發(fā)生和發(fā)展［1－5］。2008年世界衛(wèi)生組織（WHO）將JAK2V617F突變納入到上述疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)中［6］。由于JAK2 V617F是獲得性造血干細(xì)胞突變，骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同細(xì)胞系的突變。Xu X［7］等報道在37例非MDPs診斷的JAK2V617F患者中，有25例JAK2V617F突變率小于5%，因此，對于JAK2V617F檢測方法的敏感性，特別是少量突變克隆株的檢測，顯得尤為重要。

2008年，LI等［8］報道較低變性溫度下復(fù)合擴增聚合酶鏈反應(yīng)（COLD－PCR）可顯著提高少量突變的檢出率。其中快速COLD－PCR適用于變性溫度（Tc）值降低的突變，其原理是（1）任何一段DNA序列都有其嚴(yán)格、特定的Tc值，Tc值不同可致擴增效率產(chǎn)生巨大差異；（2）當(dāng)PCR反應(yīng)的Tc值設(shè)定在突變（如G：C＞A：T；G：C＞T：A等）DNA序列時，由于該Tc值低于野生型DNA片段，導(dǎo)致PCR擴增中野生型DNA片段的雙鏈大部分不能完全打開，而該Tc值可使得突變型DNA片段大部分雙鏈打開，由此即可實現(xiàn)對突變型DNA片段進行富集，然后進行分析。

由于JAK2V617F突變是G＞T點突變，適合快速COLD－PCR方法，因此，本研究采用TaqMan／MGB突變探針作為突變堿基的指示信號，結(jié)合快速COLD－PCR原理，建立高敏感性的在外周血基因組DNA中定量檢測JAK2V617F的突變率的Taq－Man－COLD－PCR方法。

1 材料與方法

1.1 純合野生、純合突變和外周血基因組DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒（目錄號：DP304－02），按試劑盒說明操作。提取的基因組DNA在－80℃凍存?zhèn)溆?。其中純合JAK2V617F突變細(xì)胞株（HEL，人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫）經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)增長期后，提取基因組DNA；純合野生（健康志愿者）和患者EDTA抗凝外周全血200μl用于基因組DNA提取。

1.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備和基因組DNA濃度校準(zhǔn)采用特異引物分別擴增純合突變和純合野生JAK2基因中第13外顯子至第14－15間內(nèi)含子共計1 818 bp，按常規(guī)方法構(gòu)建JAK2V617F野生和突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)測序確認(rèn)，并根據(jù)重組質(zhì)粒分子量將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品換算并稀釋成1×109～1×105拷貝數(shù)／ml。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為實時熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，將提取的HEL細(xì)胞株、健康志愿者和患者外周血基因組DNA的濃度校準(zhǔn)為5.0×107拷貝數(shù)／ml。

1.3 JAK2V617F突變率標(biāo)準(zhǔn)品配制 將濃度為5.0×107拷貝數(shù)／ml的健康志愿者基因組DNA作為稀釋基質(zhì)，加入同等濃度的HEL細(xì)胞基因組DNA，進行濃度梯度稀釋，配制成100%－0.1%的JAK2V617F突變標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 TaqMan－COLD－PCR引物和探針 上游引物：5′－TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA GC－3′；下游引物：5′－AGA AAG GCA TTA GAA AGC CTG TAG T－3′（由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成）。TaqMan／MGB突變探針：與突變堿基匹配（其中下劃線堿基是突變堿基），5′－FAM－TCC ACA GAA ACA TAC－MGBNFQ－3′；TaqMan／MGB通用探針：避開突變堿基，其與突變和野生皆可完全匹配，5′－VIC－ACA TAC TCC ATA ATT TA－MGBNFQ－3′，TaqMan／MGB探針由美國ABI公司合成。

1.5 檢測儀器和反應(yīng)體系構(gòu)成 20μl反應(yīng)體系，包括Taqman GT Master Mix 2×（購自美國ABI公司，目錄號：4371355）10μl，探針1μl（終濃度0.25μM），上、下游引物各2μl（終濃度分別是0.2 μM），模板2μl（濃度5.0×107拷貝數(shù)／ml），水2 μl。其中，濃度校準(zhǔn)和選擇TaqMan－COLD－PCR 的Tc值時，采用TaqMan／MGB通用探針；檢測JAK2 V617F突變率的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)本檢測采用Taq－Man／MGB突變探針。濃度校準(zhǔn)儀器采用7500Real－Time PCR系統(tǒng)（美國ABI公司 ）；TaqMan－COLD－PCR Tc值的選擇和檢測方法建立采用Rotor－Gene Q real－time PCR分析系統(tǒng) （美國QIAGEN公司）。

1.6 擴增條件 TaqMan－COLD－PCR Tc值的選擇：（1）95℃，10min；（2）95℃－76℃，15s，62℃，40 s（讀熒光值），50個循環(huán)，以確定最佳Tc值。JAK2 V617F突變率檢測：（1）95℃，10min，（2）95℃，15 s；62℃，40s；8個循環(huán)，（3）79.0℃，15s；62℃，60s（讀熒光值）；50個循環(huán)。

1.7 臨床標(biāo)本檢測 共計9例患者，其中真性紅細(xì)胞增多癥患者（PV）8例，骨髓纖維化患者（IMF）1例，采用建立的 TaqMan－COLD－PCR方法檢測JAK2V617F突變率，測序確認(rèn)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 JAK2V617突變率與循環(huán)閾值（Ct值）間的相互關(guān)系和定標(biāo)曲線的建立采用直線回歸分析，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05作為差別有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 選擇 TaqMan－COLD－PCR 的Tc值 分別以5.0×107拷貝數(shù)／ml濃度的人HEL細(xì)胞株和健康志愿者外周血基因組DNA作為模板，以TaqMan／MGB通用探針作為檢測信號，逐漸降低變性溫度，由95.0℃降至78.7℃。根據(jù)以下原則確定Taq－Man－COLD－PCR的Tc值：（1）突變和野生反應(yīng)體系擴增曲線的Ct值差別最大；（2）突變反應(yīng)體系的擴增效率最佳；最終確定TaqMan－COLD－PCR的Tc值是79.0℃，見圖1。

2.2 TaqMan－COLD－PCR檢測JAK2V617F突變率標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將Tc值設(shè)定為79.0℃，將濃度5.0×107拷貝數(shù)／ml的含有100%、10%、1%和0.1%的JAK2V617突變的標(biāo)準(zhǔn)品同時重復(fù)測定2次。結(jié)果顯示，檢測突變率的下限是0.1%，JAK2突變率的對數(shù)值與Ct值間呈線性關(guān)系，線性回歸分析顯示：r＝0.993，P＜0.001，線性回歸方程是：y＝－0.196x＋4.186。因此，根據(jù)測定的患者標(biāo)本Ct值，通過回歸方程計算即可獲得該患者JAK2 V617F突變率，計算公式是：JAK2V617F突變率＝10（4.186－0.196×Ct值）。見圖2。

圖1 TaqMan－COLD－PCR選擇Tc值的擴增曲線圖

2.3 TaqMan－COLD－PCR方法檢測患者標(biāo)本結(jié)果

測定體系包括100%－0.1%突變率標(biāo)準(zhǔn)品和100%野生純合標(biāo)準(zhǔn)品作為陰性對照，采用建立的TaqMan－COLD－PCR方法對9例患者標(biāo)本進行檢測，擴增曲線見圖3。測定的9例患者中，真紅8例，骨髓纖維化1例，8例真紅中的6例患者JAK2 V617F突變率為18.5%－50.9%，2例真紅和1例骨髓纖維化患者JAK2突變率為陰性。

圖2 TaqMan－COLD－PCR檢測JAK2V617F突變率PCR擴增曲線圖和定標(biāo)曲線圖

圖3 TaqMan－COLD－PCR測定9例患者標(biāo)本擴增曲線圖

2.4 患者標(biāo)本測序結(jié)果

將9例患者標(biāo)本通過常規(guī)PCR擴增后測序（擴增條件和引物同質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備），結(jié)果顯示，TaqMan－COLD－PCR與測序結(jié)果全部符合。見圖4。

3 討論

本研究采用TaqMan／MGB探針作為檢測信號，結(jié)合COLD－PCR擴增原理，成功建立了在外周血中定量檢測JAK2V617F突變率的TaqMan－COLD－PCR方法，該方法通過測定患者外周血基因組DNA的Ct值，再根據(jù)突變率與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算該測定標(biāo)本中JAK2V617F的突變率。所建立 TaqMan－COLD－PCR 檢測方法 可 對JAK2V617F突變率進行定量檢測，并具有高突變檢測敏感性、高通量檢測、快速和無污染等特點，由于采用外周血標(biāo)本進行檢測，還具有操作簡單的特點。

本研究建立的JAK2V617F突變率檢測方法的檢測下限是0.1%，明顯優(yōu)于其它JAK2V617F的檢測方法。文獻(xiàn)報道，DNA直接測序方法檢測突變率的下限為20%［3］；等位基因特異PCR方法 敏感性為1%－3%［9］；熒光定量PCR－ARMS原理和溶解曲線方法的敏感性為1%［10，11］，限制性片段長度多態(tài)性 （RFLP）的敏感性為20% 左右［4］。由 于JAK2V617F已作為骨髓增殖性疾病重要的分子診斷標(biāo)志物，提高該突變檢測下限的敏感度將有助于臨床對該類疾病的早期診斷。

圖4 9例患者外周血基因組DNA中JAK2 V617F突變測序結(jié)果

COLD－PCR檢測微量突變的原理是基于相同的DNA序列中野生和突變的變性溫度不同所導(dǎo)致的擴增效率差異，對于G：C與T：A的突變導(dǎo)致Tc值僅存在1℃的差異［12］，本研究在 TaqMan－COLDPCR Tc值的選擇中也觀察到突變和野生間的擴增效率差異僅相差1℃（79.6℃－78.7℃），在既保證擴增效率又保證擴增效率差異的條件下，每0.1℃的變性溫度改變都對實驗有明顯影響，因此，選擇高精度溫控的PCR擴增儀非常重要，PCR分析儀升溫達(dá)到Tc值的溫度過沖和孔間溫差是影響本實驗精確度和重復(fù)性的關(guān)鍵因素。

由于JAK2V617F是獲得性造血干細(xì)胞突變，因此骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同細(xì)胞系的突變。在外周血中，除粒系外，其它細(xì)胞系的基因組DNA 中皆不攜帶JAK2V617F突變［1，2，4］，因此，采用外周血基因組DNA檢測JAK2V617F突變率不能達(dá)到100%。本研究通過建立的TaqMan－COLD－PCR方法測定了9例患者外周血中JAK2V617F突變情況，其中6例陽性患者的JAK2V617F突變率為18.5%－50.9%，除外淋巴細(xì)胞基因組后，6例患者外周血中JAK2V617F突變率是26.2%－62.3%。

采用紫外分光光度計進行基因組DNA濃度校準(zhǔn)，通過Real－time PCR定量檢測時，其拷貝數(shù)／ml并不相同，因此本研究首先對所有的基因組DNA中JAK2基因拷貝數(shù)／ml的濃度進行校準(zhǔn)，然后再進行JAK2V617F突變率標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和患者標(biāo)本檢測。通過對基因組DNA進行拷貝數(shù)／ml的濃度校準(zhǔn)，使得本研究中JAK2V617F突變率的檢測更為準(zhǔn)確。

綜上所述，本研究建立的TaqMan－COLD－PCR方法，以外周血基因組DNA作為檢測標(biāo)本，可對JAK2V617F突變率進行定量檢測，突變率檢測下限為0.1%，該方法在一個反應(yīng)體系內(nèi)即可完成檢測，具有操作簡單、高通量檢測標(biāo)本、重復(fù)性好、檢測報告時間短等特點。由于JAK2V617F突變已作為骨髓增殖性疾病的分子診斷標(biāo)志物，該方法將明顯提高骨髓增殖性疾病的診斷靈敏度，并有助于上述疾病治療過程中治療效果的監(jiān)測。

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