韻雪雪，楊永長，姜 偉，肖代雯，閆 慧，黃文芳＊

（1.四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院，四川 成都610072；2.重慶醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗系 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶400016）

乳腺癌是一種嚴重危害育齡婦女健康的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的7－10%，據(jù)統(tǒng)計，全球每年發(fā)病約250萬人，50萬人死亡。2004年Jemal等統(tǒng)計，早期診斷乳腺癌五年生存率可達97%，而擴散后的五年生存率僅為23%［1］。影像學檢查和CA－153標志物是目前乳腺癌檢查常用的技術(shù)指標，但由于乳腺炎癥，射線過敏和敏感性方面的問題［2，3］，不足以滿足臨床和大規(guī)模篩查的需要，細胞膜在細胞生命活動中發(fā)揮重要作用，已有研究發(fā)現(xiàn)膜蛋白腫瘤過程中發(fā)生特異性變化［4］，SELDI－TOF－MS是目前蛋白研究的先進技術(shù)，具有高通量，檢測快速，敏感度和特異性高，分析全面精確的特點，在蛋白質(zhì)組學研究中應(yīng)用廣泛，本實驗擬通過SELDI－TOF－MS分析乳腺癌及正常乳腺細胞株膜，尋找差異蛋白，為乳腺癌亞細胞蛋白水平標志物的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人類乳腺正常細胞株HBL－100購自上海中科院細胞庫，人類乳腺癌細胞株MDA－MB－231及MCF－7均由重慶醫(yī)科大學惠贈。

1.1.2 主要試劑及來源 細胞膜蛋白提取試劑盒購自Sigma公司，小牛血清，1640培養(yǎng)基，0.25%胰酶均購自GIBCO公司，TritonX－114購自Amresco公司，芥子酸（SPA）、乙腈（ACN）、三氟乙酸（TFA）、細胞色素C和肌紅蛋白均購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱由德國Heraeus生產(chǎn)；表面增強激光解吸蛋白飛行時間質(zhì)譜（SELDITOF－MS）儀、Au蛋白質(zhì)芯片為Ciphergen公司產(chǎn)品；Vortex－Genie 2渦旋振蕩器為美國Scientific Industries公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與收集細胞MDA－MB－231，MCF－7，HBL－100培養(yǎng)于含有10%的小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中，細胞貼壁70－90%時傳代，加入PBS洗2次，2×107每管凍于－80℃冰箱保存。

1.2.2 膜蛋白蛋白的分離純化 膜蛋白的分離純化按照試劑盒說明進行，步驟為：①每管細胞中加入600μl的裂解液，冰浴10min，②4℃×10 000g離心細胞5min，轉(zhuǎn)移上清至以新的管中，③37℃孵育5min，可以觀察到液體變?yōu)樵旗F狀渾濁。④37℃×3 000g離心3min，棄上清下部沉淀為細胞膜脂筏蛋白和疏水性蛋白。

1.2.3 丙酮沉淀 加預冷丙酮至膜蛋白提取物，－20℃冰箱沉淀過夜，4℃×12 000g離心10min，棄上清重復丙酮沉淀即為膜蛋白，加4‰Tritonx－114充分溶解。

1.2.4 蛋白定量 Olympus AU 2700生化分析儀檢測各管中蛋白量，用4‰TritonX－114調(diào)節(jié)樣品濃度為100μg／μl。

1.2.5 質(zhì)量校準 SELDI－TOF－MS儀每次使用前，采用蛋白標準品胰島素、細胞色素C和肌紅蛋白對SELDI－TOF－MS進行相對分子質(zhì)量校準，確保系統(tǒng)的質(zhì)量偏差范圍控制在0.1%以內(nèi)。

1.2.6 SELDI－TOF－MS分析蛋白指紋圖譜 10 μl 50%飽和SPA（能量分子，含50%ACN和0.5%TFA）與經(jīng)過處理的等體積膜蛋白樣品混合，上樣Au蛋白芯片，每孔4μl，每個標本重復2條芯片，每條2個點，待干后每孔重復加入1μl SPA2次，完全干燥后，選擇激光強度為190，靈敏度為8，SELDITOF－MS分析蛋白指紋圖譜，Protein－chip Software Bio－maker自動采集數(shù)據(jù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)收集處理 采用Biomarker Wizard 3.1軟件對乳腺癌和正常乳腺細胞線粒體蛋白質(zhì)分別進行指紋圖譜分析，設(shè)定有意義的蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)頻率閾值為10%，分別設(shè)定5，2兩次信噪比（S／N）過濾。確定兩組間蛋白質(zhì)峰值比較時，對初步篩選的蛋白質(zhì)峰進行t檢驗，以P＜0.05篩選差異蛋白。

1.2.8 溶劑影響 4‰TritonX－114與SPA等量混合，按照1.2.6條件點樣分析蛋白指紋圖。

1.2.9 長期凍存對結(jié)果影響 選擇－80℃凍存達3－6個月的細胞，提取膜蛋白分析指紋圖譜，與新收集細胞膜蛋白指紋圖譜比較，觀察兩者蛋白峰數(shù)目及豐度有無統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 細胞膜蛋白指紋圖譜分析結(jié)果

經(jīng)蛋白指紋圖譜標準化后，MDA－MB－231和MCF－7與HBL－100相比，膜蛋白差異點分別為32個和34個（P＜0.05），其中7.8kD，8.3kD和8.8 kD的蛋白在兩株癌細胞中表達均降低，9.6kD的蛋白在兩株癌細胞中表達均增高，見表1和圖1、2。

表1 乳腺正常細胞膜與乳腺癌細胞膜差異蛋白（kD）

圖1 分子量7.8kD和8.3kD的差異蛋白指紋圖

圖2 分子量8.8kD和9.6kD的差異蛋白指紋圖

2.2 溶液對結(jié)果影響分析

蛋白指紋圖譜分析4‰TritonX－114點樣Au蛋白芯片后除基質(zhì)峰外無任何蛋白峰，證明該濃度TritonX－114對結(jié)果分析無影響，見圖3。

圖3 芯片洗滌后點樣4‰TritonX－114分析圖譜

2.3 長期凍存對結(jié)果影響分析

新鮮提取細胞與凍存3－6個月的細胞線粒體蛋白指紋圖譜比較，兩者在蛋白峰的數(shù)量和豐度上均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），表明在此時間范圍內(nèi)保存不影響結(jié)果分析，見圖4。

圖4 新鮮細胞與凍存細胞膜蛋白指紋圖譜

3 討論

細胞膜蛋白約占蛋白總量的1／3，在信號傳遞，物質(zhì)轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮重要的作用，腫瘤細胞膜蛋白連接數(shù)量少而且發(fā)育差，微絨毛數(shù)量增多，一些質(zhì)膜蛋白如受體蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、黏附蛋白、抗原蛋白等過量表達、缺失或發(fā)生修飾，使細胞的信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)運輸、黏附作用、免疫原性等發(fā)生改變，與腫瘤細胞的惡性行為如侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時膜蛋白是藥物作用靶點之一，目前80%臨床使用藥物的靶點都集中在膜蛋白上，細胞膜蛋白改變時，會引起細胞對藥物的反應(yīng)改變，導致化療失敗。在乳腺癌中，Jensen等［5］研究發(fā)現(xiàn)一種以γ－氨基丁酸A型受體為配體的氯離子通道蛋白異常表達。Garcia Pedrero JM［6］等發(fā)現(xiàn)AnnexinA1在乳腺癌中表達下調(diào)，其下調(diào)程度與其上皮分化狀態(tài)、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、組織病理學分級密切相關(guān)，惡性程度越高，表達下調(diào)程度越明顯。Adam P J等［7］通過對乳腺癌細胞質(zhì)膜大規(guī)模蛋白質(zhì)組學分析，建立了500多個的蛋白的乳腺癌細胞質(zhì)膜蛋白數(shù)據(jù)集，其中27%功能未知，進一步的定位實驗、相互作用分析和免疫組化發(fā)現(xiàn)了3個以前未鑒定的蛋白質(zhì)BCMP11、BCMP84和BCMP101可能在癌變過程中起作用。

SELDI－TOF－MS問世以來，因其分析速度快，相對分子質(zhì)量范圍大，可以有效捕獲低分子量、低豐度的蛋白的特點，在亞細胞蛋白研究中得到極大的應(yīng)用，已通過SELDI－TOF－MS在乳腺癌全細胞蛋白研究中捕獲標志物［8］。本實驗利用SELDI－TOFMS檢測兩株乳腺癌及一株乳腺正常上皮細胞株膜蛋白，發(fā)現(xiàn)分子量7.8kD，8.3kD和8.8kD的蛋白在兩株癌細胞中表達均降低，分子量9.6kD的蛋白在兩株癌細胞中表達均增高。同時本實驗選擇的Au芯片，與以往CM10，WCX等相比，可以重復利用，成本極低，適合大面積篩查。在標本保存時間上，比較－80℃凍存3－6月的細胞膜蛋白與新鮮細胞膜蛋白指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)兩者在蛋白峰數(shù)目及豐度均無統(tǒng)計學差異，表明在此范圍內(nèi)保存不影響指紋圖譜分析，與既往研究一致［9］。提示本實驗可用于長期保存標本的研究。

本實驗在亞細胞水平初步篩選出了乳腺癌特異性蛋白，但能否將篩選的蛋白用于乳腺癌的診斷，還有很長的路要走。在下一步實驗中，我們對差異蛋白分離、純化和鑒定，同時收集各種類型的臨床標本進行驗證，以期為乳腺癌標志物研究鑒定更多依據(jù)。

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［3］Hinestrosa MC，Dickersin K，Klein P，et al.Shaping the future of biomarker research in breast cancer to ensure clinical relevance［J］.Nat Rev Cancer，2007，7（4）：309.

［4］Kanzaki A，Yoi M，Nakayama K，et al.Expression of multidrug resistanc－related transporters in human breast carcinoma［J］.J Cancer Res，2001，92（4）：452.

［5］Roberts SS，Mendona－Torres MC，Jensen K.et al.GABA receptor expression in benign and malignant thyroid tumors［J］.Pathol Oncol Res.，2009，15（4）：645.

［6］Garcia Pedrero JM，F(xiàn)ernandez MP，Morgan RO ，et al.Annexin A1down－regulation in head and neck cancer is associated with epithelial differentiation status［J］.Am J Pathol，2004，164（1）：73.

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