李沐潔 奚 茜 張明洲， 陳宗倫 王唯芬

(浙江省生物計(jì)量與檢驗(yàn)檢疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院1，杭州 310018)

(杭州迪恩科技有限公司2，杭州 310013)

赭曲霉毒素A直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的研制

李沐潔1奚 茜1張明洲1，2陳宗倫2王唯芬1

(浙江省生物計(jì)量與檢驗(yàn)檢疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院1，杭州 310018)

(杭州迪恩科技有限公司2，杭州 310013)

在多克隆抗體的基礎(chǔ)上研制了赭曲霉毒素A(OTA)直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)(cd－ELISA)試劑盒。在0～10 ng/mL范圍內(nèi)，該試劑盒50%抑制率(IC50)為1.09 ng/mL，檢測(cè)靈敏度(IC15)為0.08 ng/mL;與赭曲霉毒素B、C的交叉反應(yīng)率分別為6.28%和0.16%，而與黃曲霉毒素B1等生物毒素未見(jiàn)有交叉反應(yīng);板內(nèi)與板間平均變異系數(shù)分別為2.21%和2.79%;花生、玉米和玉米粉3種樣品中OTA的檢測(cè)低限分別為1.71，1.26和1.85 μg/kg，平均添加回收率在83.80%～91.40%;與 HPLC 檢測(cè)方法具有較高的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.94、0.88和0.90;檢測(cè)時(shí)間只需20 min，可用于花生、玉米及玉米粉中OTA的批量快速篩查。

赭曲霉毒素A 多克隆抗體 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

赭曲霉毒素主要是由赭曲霉(Aspergillus ochraceus)及純綠青霉(Penicillium viridicatum)等有毒真菌在惡劣環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］，屬烈性的肝臟和腎臟毒素。它包括7種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物，其中毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對(duì)農(nóng)作物污染最重、對(duì)人和動(dòng)物影響最大的是赭曲霉毒素A(OTA)。OTA具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、以及致畸、致癌和致突變作用等多種毒性，對(duì)動(dòng)物和人體健康有很大的潛在危害［2］。1993年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(The International Agency for Research on Cancer，LARC)將 OTA定為2B類致癌物(即可能引起人類癌癥的物質(zhì))［3］。因此世界各國(guó)均重視對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)和控制，歐盟于2006年12月19日制定歐盟委員會(huì)條例(EC)No1881/2006［4］，規(guī)定谷物原料中 OTA 最大限量為 5 μg/kg，谷物加工制品和直接供人食用的谷物中最大限量為3 μg/kg，嬰幼兒食品及有特殊醫(yī)療目的嬰兒食品中不超過(guò)0.5 μg/kg;我國(guó)也規(guī)定供人食用谷類和豆類中 OTA 的最大限量為 5 μg/kg［5］。

目前OTA的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC)［6－8］、高效液相色譜法(HPLC)［9－11］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［12－13］、酶聯(lián)免疫吸附法［14－16］等。但色譜分析需要昂貴的儀器、復(fù)雜的樣品預(yù)處理(凈化，濃縮或衍生)和大量的有機(jī)溶劑和其他化學(xué)品［17］，不能滿足基層大規(guī)模篩查和現(xiàn)場(chǎng)抽檢的需要。酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法可以在較短時(shí)間內(nèi)完成大量樣品的分析，操作簡(jiǎn)便，成本比較低，適合作為大量陰性樣品的快速篩選［18］。本研究在制備OTA特異性多克隆抗體的基礎(chǔ)上，采用直接包被抗體的方法成功研制出OTA直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫(cd－ELISA)檢測(cè)試劑盒，為谷物中OTA免疫快速篩檢方法的建立和擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1、嘔吐毒素與T－2毒素:以色列Fermantek公司;人血清白蛋白(HSA)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、3，3'，5，5'－ 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、弗氏完全與不完全佐劑、N－羥基琥珀酰胺(NHS)、N，N－二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)、N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、N，N'－羰基二咪唑(CDI):美國(guó)Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA):美國(guó)Amesco公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG:美國(guó)Pierce公司;色譜純甲醇、乙腈:美國(guó)Tedia公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

磷酸鹽緩沖溶液(PBS):0.01 mol/L，pH 7.4;洗液(PBST):含 0.05%Tween－20的 PBS;包被液(CBS):0.1 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液;封閉液:含5%OVA的PBST;終止液:2 mol/L硫酸。

1.2 主要儀器與耗材

UV－4802S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):美國(guó)Unico公司;VE－180垂直電泳槽、EPS－300數(shù)顯穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:上海天能科技有限公司;Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng):美國(guó)Bio－rad公司;Multiskan Ascent全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀:美國(guó)Thermo公司;H P1100高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器):美國(guó)Agilent公司;96孔酶標(biāo)板:美國(guó)Corning－Costar公司。

1.3 OTA人工抗原的合成與鑒定

采用活潑酯法合成OTA人工抗原(圖1)。準(zhǔn)確稱取 3.5 mg OTA、3.8 mg NHS 和13.6 mg DCC 溶于0.5 mL DMF中，室溫下避光攪拌反應(yīng)18 h，吸取100 μL上述溶液，冰浴條件下逐滴加入1.75 mg BSA(溶于 0.75 mL 0.13 mol/L NaHCO3溶液)中，室溫下避光攪拌反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，4℃下PBS透析3 d［19］。同法合成包被抗原OTA－HSA。人工抗原采用紫外光譜掃描、SDS－PAGE電泳與紅外掃描(波數(shù)400～4 000 cm－1)鑒定。

圖1 OTA人工抗原合成路線

1.4 OTA酶標(biāo)抗原的制備

準(zhǔn)確稱取2 mg OTA溶于100 μL丙酮，加入3 mg CDI，室溫避光攪拌反應(yīng)20 min后逐滴加入4 mg HRP(溶于1.5 mL 0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液)中，室溫避光攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，4℃下PBS透析3 d［20］。

1.5 多克隆抗體的制備及效價(jià)測(cè)定

將1 mg/mL OTA－BSA與等量佐劑乳化(第1次免疫用弗氏完全佐劑，以后加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑)，采用背腹部皮下多點(diǎn)注射方式免疫2.5～3 kg體重新西蘭大白兔，共免疫4次，首次免疫劑量為 0.5 mg/(mL·只)，加強(qiáng)免疫為 0.25 mg/(mL·只)。第4次加強(qiáng)免疫后10 d心臟采血。血清經(jīng)辛酸－硫酸銨分離純化后由SDS－PAGE電泳鑒定并采用間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。

1.6 OTA直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(cd－ELISA)的建立

1.6.1 抗體與酶標(biāo)抗原最適工作濃度的確定

用CBS將抗體倍比稀釋(1∶500～1∶3 000)后包被 96 孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，37 ℃ 孵育 2 h，PBST洗滌3次;200 μL/孔封閉液，37 ℃封閉 2 h，PBST洗滌3次;加入PBS倍比稀釋的OTA酶標(biāo)抗原(1∶100 ～1∶800)，100 μL/孔，37 ℃ 孵 育 10 min，PBST 洗滌3 次;加入顯色劑，100 μL/孔，37 ℃ 孵育10 min;每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD450nm值。選擇OD450nm值為1.0左右的組合［21］。

1.6.2 OTA與酶標(biāo)抗原最佳反應(yīng)模式的確定

在抗體與酶標(biāo)抗原最適工作濃度下，加入PBS或PBS配制的10 ng/mL OTA與酶標(biāo)抗原(A:50 μL PBS或 OTA+100 μL 酶標(biāo)抗原;B:100 μL PBS 或OTA+100 μL 酶標(biāo)抗原;C∶100 μL PBS 或 OTA+50 μL 酶標(biāo)抗原;D∶50 μL PBS 或 OTA+50 μL 酶標(biāo)抗原)，按1.6.1測(cè)定各孔的OD450nm值并計(jì)算4種模式下方法對(duì)10 ng/mL OTA的抑制情況，選擇抑制效果好的反應(yīng)模式。

1.6.3 OTA 直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA(cd－ELISA)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在最佳工作濃度和反應(yīng)模式下，PBS配制OTA系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(10、5、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0 ng/mL)，采用cd－ELISA測(cè)定OD450nm值。以結(jié)合率(B/B0，B是不同質(zhì)量濃度的 OTA標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值，B0是 OTA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為 0時(shí)的OD450nm值)為縱坐標(biāo)，OTA不同質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分別計(jì)算50%(IC50)和15%(IC15)抑制濃度，以IC50衡量抗體對(duì)OTA的親合性，以IC15衡量OTA cd－ELISA法的檢測(cè)靈敏度。結(jié)合率與抑制率計(jì)算公式如下:

1.6.4 方法的特異性分析

在cd－ELISA最佳工作條件下，將赭曲霉毒素B、C及其他生物毒素(黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1、嘔吐毒素與T－2毒素)作為抑制劑，測(cè)定各抑制劑50%抑制濃度(IC50)，以抗體對(duì)OTA的IC50與對(duì)各抑制劑的IC50之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率(CR)，通過(guò)交叉反應(yīng)率高低衡量方法的特異性。交叉反應(yīng)率(CR)按式(3)計(jì)算:

1.6.5 方法的準(zhǔn)確性分析

通過(guò)在同一酶標(biāo)板上做6組平行cd－ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線和分別在6個(gè)包被批次的酶標(biāo)板上各做1組平行cd－ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行板內(nèi)與板間變異系數(shù)分析，研究不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6.6 樣品添加回收試驗(yàn)與最低檢出限分析

1.6.6.1 樣品前處理方法

精確稱取粉碎樣品2 g于50 mL可密封的離心管中，加入10 mL提取液(50%的甲醇水溶液)，于振蕩器上振蕩提取5 min，用濾紙過(guò)濾，或者5 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.6.6.2 樣品基質(zhì)影響試驗(yàn)

取花生、玉米和玉米粉陰性樣品，按1.6.6.1方法分別制備提取上清液，以PBS稀釋1、2.5和5倍不同處理;以PBS為對(duì)照，每處理用于配制系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.6.3方法建立4條標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析樣品基質(zhì)對(duì)OTA cd－ELISA的影響。

1.6.6.3 檢測(cè)低限分析

隨機(jī)抽取陰性樣品，按1.6.6.1方法前處理并消除基質(zhì)影響后以建立的OTA cd－ELISA分析，檢測(cè)低限(LOD)以陰性樣品的平均測(cè)定值(n=20)加上其3倍的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算。

1.6.6.4 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在花生、玉米和玉米粉陰性樣品中分別添加OTA標(biāo)準(zhǔn)品至5、10和25!g/kg，每濃度重復(fù)做3次，每個(gè)重復(fù)設(shè)2孔平行。樣品按1.6.6.1方法前處理并消除基質(zhì)影響后，cd－ELISA測(cè)定OD450nm值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品添加回收率:

1.6.7 與HPLC比對(duì)試驗(yàn)

1.6.7.1 色譜條件［22］

色譜柱:Hypersil C18(150 mm ×4.6 mm，3 μm);柱溫:室溫;流動(dòng)相:乙腈/水/乙酸(99/99/2，體積比);流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;激發(fā)波長(zhǎng):330 nm;發(fā)射波長(zhǎng):450 nm。

1.6.7.2 OTA 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

乙腈配制OTA系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(100、40、20、10、1、0 ng/mL)，采用上述色譜條件測(cè)定各濃度下的色譜峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.7.3 樣品前處理［23］

取粉碎后的樣品5 g，加入25 mL甲醇，超聲提取20 min，過(guò)濾;取適量甲醇潤(rùn)洗容器和濾紙，合并甲醇溶液;將甲醇提取液減壓蒸干，取5 mL流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣分析。以保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.6.7.4 比對(duì)方法

在花生、玉米和玉米粉粉碎陰性樣品中分別添加 OTA 標(biāo)準(zhǔn)品至 5、10、25、50 μg/kg，分別用 HPLC與ELISA方法提取測(cè)定，每個(gè)樣品添加濃度重復(fù)6次，以HPLC測(cè)定值為橫坐標(biāo)、ELISA測(cè)定值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行回歸分析，以相關(guān)系數(shù)(R2)衡量2種方法的相符性。

2 結(jié)果與討論

2.1 OTA人工抗原鑒定

2.1.1 紫外掃描分析

將 OTA、BSA、HSA、OTA －BSA、OTA －HSA 溶液用PBS稀釋到合適濃度后進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明(圖2)，載體蛋白BSA、HSA在280 nm有特征吸收，OTA在333 nm具有特征吸收峰，反應(yīng)產(chǎn)物的圖譜與載體蛋白、OTA的圖譜都有所不同。同時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收峰波長(zhǎng)與載體蛋白、OTA的比較都有所移動(dòng)，這說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物是不同于載體蛋白和半抗原的物質(zhì)，是載體蛋白和OTA的復(fù)合物。

圖2 OTA人工抗原的紫外掃描圖

2.1.2 SDS－PAGE 電泳分析

OTA人工抗原SDS－PAGE電泳結(jié)果如圖3所示，第3、5泳道分別明顯滯后于第2、4泳道，說(shuō)明載體BSA或HSA經(jīng)合成反應(yīng)后連接上了一定數(shù)目的OTA，從而使得分子質(zhì)量增大。

圖3 OTA人工抗原SDS－PAGE電泳圖

2.1.3 紅外掃描分析

將OTA、BSA和OTA－BSA凍干粉與適量KBr混勻研磨后壓片進(jìn)行紅外掃描，從圖4可以看出，反應(yīng)產(chǎn)物的圖譜與載體蛋白、半抗原的圖譜存在一定差異。與OTA相比，產(chǎn)物在羧基中氧氫鍵所在的3 000 cm－1處的吸收峰的峰型不明顯，而與BSA相比，產(chǎn)物在1 530 cm－1處伯氨基的吸收峰明顯降低，可以推測(cè)這是由于OTA的羧基與BSA的伯氨基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)形成肽鍵，導(dǎo)致羧基和伯氨基大量減少造成的，再結(jié)合紫外光譜圖和SDS－PAGE結(jié)果，證明OTA與BSA確已發(fā)生了偶聯(lián)反應(yīng)。

圖4 OTA人工免疫原的紅外掃描圖

2.2 血清純化結(jié)果

血清經(jīng)純化由SDS－PAGE(圖5)鑒定可知，其在2、4泳道中僅呈現(xiàn)2條帶，分子質(zhì)量大約在52 ku和26 ku左右，分別與抗體的重、輕鏈分子質(zhì)量55 ku和26 ku大小一致，其他條帶均消失，說(shuō)明血清純化達(dá)到較好的效果。

圖5 血清抗體SDS－PAGE電泳圖

2.3 抗體效價(jià)測(cè)定

用CBS將包被抗原OTA－HSA稀釋成2 μg/mL后包被96孔酶標(biāo)板，采用間接ELISA測(cè)定純化抗體效價(jià)。OD450nm值為0.8～1.0左右時(shí)抗體的稀釋倍數(shù)即為其效價(jià)。從表1可看出OTA抗體的效價(jià)為1∶3 000。

表1 OTA抗體效價(jià)測(cè)定

2.4 OTA直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(cd－ELISA)的建立

2.4.1 OTA抗體與酶標(biāo)抗原最適工作濃度的確定

根據(jù)棋盤法結(jié)果(表2)，選擇 OD450nm值為1.0左右的組合?？紤]到陰性值越低對(duì)檢測(cè)影響越小，以及節(jié)約抗體、酶標(biāo)抗原使用量的原則，最后確定包被抗體稀釋3 000倍，酶標(biāo)抗原稀釋200倍時(shí)為最佳工作濃度。

表2 OTA抗體和酶標(biāo)抗原最佳工作濃度的確定

2.4.2 OTA與酶標(biāo)抗原最佳反應(yīng)模式的確定

結(jié)果如表3，考慮到抑制情況，最后確定OTA加樣量為100 μL，酶標(biāo)抗原為50 μL為最佳反應(yīng)模式。

表3 反應(yīng)模式的確定

2.4.3 OTA cd－ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用CBS將抗體稀釋3 000倍后包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，37℃ 孵育 2 h，PBST 洗滌 3 次;200 μL/孔封閉液，37℃封閉2 h，PBST洗滌 3次;加入100 μL OTA 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(10、5、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0 ng/mL)與 50 μL PBS 稀釋 200 倍的OTA酶標(biāo)抗原，37℃孵育10 min，PBST洗滌 3次;加入顯色劑，100 μL/孔，37 ℃孵育10 min;每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD450nm值。

以結(jié)合率為縱坐標(biāo)、OTA濃度為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。在0.1～10 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)結(jié)合率與濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y= －0.347 6x+0.878 3，R2=0.991 9，50%抑制率IC50=1.09 ng/mL，方法的檢測(cè)靈敏度 IC15=0.08 ng/mL。

圖6 OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.4 方法的特異性分析

OTA抗體對(duì)其類似物赭曲霉毒素B、C的交叉反應(yīng)率分別為6.28%和0.16%;而對(duì)黃曲霉毒素B1等生物毒素的交叉反應(yīng)率均小于0.01%(表4)。說(shuō)明以本研究獲得的OTA抗體建立的cd－ELISA檢測(cè)方法具有良好的特異性，其他生物毒素對(duì)OTA檢測(cè)的干擾較小。

表4 交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

2.4.5 方法的準(zhǔn)確性分析

結(jié)果表明(表 5)，各濃度板內(nèi)變異系數(shù)在0.73%～3.79%之間，平均變異系數(shù)為 2.21%，板間變異系數(shù)在1.67%～4.29%之間，平均變異系數(shù)為2.79%。說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性較高，可以滿足谷物中OTA含量分析的基本要求。

表5 板內(nèi)與板間變異系數(shù)

2.4.6 樣品基質(zhì)影響分析

與對(duì)照(樣品稀釋液)相比較，樣品基質(zhì)被稀釋1倍和2.5倍時(shí)，樣品基質(zhì)仍對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線有一定影響;稀釋5倍時(shí)，0.1～10 ng/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線變化不大(圖7)。因此，花生、玉米和玉米粉3種樣品選擇5倍稀釋來(lái)消除基質(zhì)影響。

圖7 樣品基質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響

2.4.7 方法的檢測(cè)低限分析

從表6可見(jiàn)，花生、玉米及玉米粉中OTA的檢測(cè)低限分別為1.71、1.26 和 1.85!g/kg。

表6 花生、玉米與玉米粉的檢測(cè)低限/!g/kg

2.4.8 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)

花生、玉米和玉米粉陰性樣品中，OTA在添加5～25!g/kg的平均回收率在83.80%～91.40%范圍內(nèi)(表7)，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性較高。

表7 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(平均值)

2.5 HPLC 比對(duì)試驗(yàn)

添加 5、10、25 和 50 μg/kg OTA 的花生、玉米和玉米粉樣品分別采用ELISA和HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)。

圖8 ELISA與HPLC方法檢測(cè)OTA含量的相關(guān)性

結(jié)果表明(圖8)，花生、玉米和玉米粉樣品中2種檢測(cè)方法的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.94、0.88與0.90，表明本研究建立的ELISA方法與HPLC方法具有較高的相符性，可用于谷物中OTA批量快速篩查。

3 結(jié)論

OTA屬于一種小分子半抗原，本身沒(méi)有免疫原性，必須與載體蛋白大分子連接才能產(chǎn)生完整的免疫應(yīng)答。通過(guò)活潑酯法，利用OTA上的—COOH將之與載體蛋白BSA連接，后免疫兔子獲得了高效價(jià)和高特異性多克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上研制了OTA cd－ELISA檢測(cè)試劑盒。該試劑盒IC50為1.09 ng/mL，IC15為0.08 ng/mL;與赭曲霉毒素B、C的交叉反應(yīng)率分別為6.28%和0.16%，而與其他毒素未見(jiàn)有交叉反應(yīng);在花生、玉米及玉米粉中的檢出低限分別為1.71，1.26 和1.85 μg/kg，平均回收率在 83.80%～91.40%;與HPLC檢測(cè)方法具有較高的相符性;檢測(cè)時(shí)間短，只需20 min;顯示出較好的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確性、及簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，可滿足花生、玉米及玉米粉中OTA的免疫快速檢測(cè)。

［1］RatolaN，Martins L，Alves A.Ochratoxin A in wines－ assessing global uncertainty associated with the results［J］.Analytica Chimica Acta，2004，513(1):319 －324

［2］舒黛廉，王玨.乳及乳制品中抗生素殘留微生物檢測(cè)法研究進(jìn)展及其控制措施［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35(1):74－77

［3］高翔，李梅，張立實(shí).赭曲霉毒素A的毒性研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2005，32(1):51－55

［4］European Commission.(EC)No 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs［s］.Official Journal of the European Union，2006 －12 －20

［5］GB 2715—2005糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］

［6］Santos E A，Vargas E A.Immunoaffinity column clean － up and thin layer chromatography for determination of ochratoxin A in green coffee［J］.Food Additives and Contaminants，2002，19(5):447 －458

［7］Pittet A，Royer D.Rapid，low cost thin －layer chromatographic screening method for the detection of ochratoxin A in green coffee at a control level of 10 μg/kg［J］.Journal of Agricultural and Food Chmistry，2002，50(2):243 －247

［8］Meritxell V，Ivan A，F(xiàn)rancesc B P，et al.Two － dimensional thin－layer chromatographic method for the analysis of ochratoxin A in green coffee［J］.Journal of Food Protection.2005，68(9):1920－1922

［9］Tessini C，Mardones C，Baer V D，et al.Alternatives for sample pre－treatment and HPLC determination of ochratoxin A in red wine using fluorescence detection［J］.Analytica Chimica Acta，2010，660(1 －2):119 －126

［10］褚慶華，郭德華，王敏，等.油料和食用油中真菌毒素快速測(cè)定方法的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2006，21(2):114 －120

［11］Vega M，Munoz K，Sepúlveda C，et al.Solid － phase extraction and HPLC determination of Ochratoxin A in cereals products on Chilean market［J］.Food Control，2009，20(7):631－634

［12］Lattanzio V M T，Solfrizzo M，Powers S，et al.Simultaneous determination of aflatoxins，ochratoxin A and Fusarium toxins in maize by liquid chromatography/tandem mass spectrometry after multitoxin immunoaffinity cleanup［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007，21(20):3253 －3261

［13］Vatinno R，Vuckovic D，Zambonin C G，et al.Automated high－throughput method using solid－phase microextraction－liquid chromatography－tandem mass spectrometry for the determination of ochratoxin A in human urine［J］.Journal of Chromatography A，2008，1201(2):215 －221

［14］Fujii S，Ribeiro R M R，dos Santos Scholz M B ，et al.Reliable indirect competitive ELISA used for a survey of ochratoxin A in green coffee from the North of Paraná State，Brazil［J］.Food Additives and Contaminants，2006，23(9):902 －909

［15］Flajs D，Domijan A M，Ivic＇B，et al.ELISA and HPLC analysis of ochratoxin A in red wines of Croatia［J］.Food Control，2009，20(6):590 －592

［16］Klaric＇M S，Cvetnic＇Z，Pepeljnjak S，et al.Co － occurrence of aflatoxins，ochratoxin A，fumonisins，and zearalenone in cereals and feed，determined by competitive direct enzyme －linked immunosorbent assay and thin－layer chromatography［J］.Archives of Industrial Hygiene and Toxicology，2009，60(4):427－434

［17］Chun H S，Choi E H，Chang H J，et al.A fluorescence polarization immunoassay for the detection of zearalenone in corn［J］.Analytica Chimica Acta，2009，639(1 －2):83 －89

［18］王松雪，李愛(ài)科，謝剛，等.糧食飼料資源霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2006，21(3):415－418

［19］M?rtlbauer E，Gareis M，Terplan G.Enzyme immunoassay for the macrocyclic trichothecene roridin A:production，properties，and use of rabbit antibodies［J］.Applied and Environment Microbiology，1988，54(1):225 －230

［20］Xiao H，Clarke J R，Marquardt R R，et al.Improved methods for conjugating selected mycotoxins to carrier proteins and dextran for immunoassays［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43(8):2092 －2097

［21］王海艷，袁飛，吳亞君，等.食品中過(guò)敏原胡桃蛋白間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2010，10(5):217－222

［22］Aboul－Enein H Y，Kutluk ? B，Altiokka G，et al.A modified HPLC method for the determination of ochratoxin A by fluorescence detection［J］.Biomedical Chromatography，2002，16(7):470 －474

［23］王向紅，劉濤，王忠斌，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定谷物中的赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2008，8(5):148 －152.

Development of a Direct Competitive ELISA
Kit for Rapid Detection of Ochratoxin A

Li Mujie1Xi Xi1Zhang Mingzhou1，2Chen Zonglun2Wang Weifen1
(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Bio － metrology，Inspection and Quarantine College of Life Science，China Jiliang University1，Hangzhou 310018)
(DNA Scitech Co.，Ltd.2，Hangzhou 310013)

A direct competitive enzyme－linked immunosorbent assay(cd－ELISA)kit based on ochratoxin A(OTA)polyclonal antibodies was developed.In the 0 ～10 ng/mL range，the OTA ELISA kit had a good sensitivity with an IC50of 1.09 ng/mL and IC15of 0.08 ng/mL，showed 6.28%，0.16%cross－ reactivitives to ochratoxin B and C respectively，and scarcely showed cross－ reactivity to others.The mean variation coefficient of intra － assay and inner－assay were 2.21%and 2.79%.The limit of detection in peanut，maize and maize flour samples were 1.71，1.26 and 1.85 μg/kg，respectively，and spiked recovery ranged from 83.80%to 91.40%.Compared with HPLC，the correlation coefficients(R2)were 0.94、0.88 and 0.90 for peanut，maize and maize flour，respectively.And the detection time of the kit is 20 minutes.It is indicated that the OTA ELISA kit in this paper was applicable to rapid preliminary screening of OTA.

ochratoxin A，polyclonal antibody，cd－ELISA

TS207.3

A

1003－0174(2012)09－0116－08

浙江省重大科技專項(xiàng)(2006C12102)，杭州市重大科技創(chuàng)新專項(xiàng)(20083212A25)，浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2010R50028)，浙江省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2011E 61018)

2011－12－20

李沐潔，女，1986年出生，碩士，生物化學(xué)與分子生物學(xué)

張明洲，男，1970年出生，教授，碩士生導(dǎo)師，食品質(zhì)量與安全