何榮海 翟慶嬌 仲晗實 劉 磊 蔣 邊 廖 艷 馬海樂

(江蘇大學食品與生物工程學院江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點實驗室1，鎮(zhèn)江 212013)

(西北農(nóng)林科技大學食品學院2，楊凌 712100)

微波輔助回流提取葵花籽粕綠原酸的研究

何榮海1翟慶嬌1仲晗實2劉 磊1蔣 邊1廖 艷1馬海樂1

(江蘇大學食品與生物工程學院江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點實驗室1，鎮(zhèn)江 212013)

(西北農(nóng)林科技大學食品學院2，楊凌 712100)

以微波輔助回流提取的方法從葵花籽粕中提取綠原酸。研究了微波輔助提取綠原酸過程中料液比、微波輻射功率、乙醇體積分數(shù)以及提取時間對綠原酸得率影響的單因素試驗，并在單因素試驗基礎(chǔ)上進行了正交試驗，得出優(yōu)化的微波輔助回流提取參數(shù)為:料液比1∶18、微波輻射功率390 W、乙醇體積分數(shù)35%和提取時間20 min，在此條件下綠原酸提取率達到94.6%、得率為2.11%。對提取的綠原酸產(chǎn)品進行抗氧化試驗，結(jié)果表明葵花籽粕綠原酸對DPPH自由基有顯著清除作用，其對DPPH自由基的EC50值為 2.6 mg/L。

葵花籽粕 綠原酸 微波輔助回流提取

葵花籽是一種重要油料作物，我國葵花籽資源豐富，年產(chǎn)量達125萬噸［1］，葵花籽提取油脂后的葵花籽粕(Sunflower Seed Meal，SSM)營養(yǎng)價值較高，但一般用作飼料或肥料，對其深加工利用報道不多，曾有人研究從葵花籽粕制備分離蛋白［2］，研究者也曾從葵花籽粕蛋白制備得到降血壓肽(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽)［3］。葵花籽粕除富含蛋白質(zhì)外，綠原酸質(zhì)量分數(shù)也很豐富達1.1%～4.5%，綠原酸有較高的藥用價值，還可作為抗氧化劑用于食品工業(yè)［4］。

植物中綠原酸的提取方法較多，如水提醇沉法［5］、醇提鉛鹽沉淀法［6］、超聲波法［7］、超臨界 CO2萃取法［8］、超濾法［9］以及酶法［10］等。不過這些方法都存在一些缺陷，如水提醇沉法醇沉過程中伴隨吸附夾帶，使部分綠原酸消失;醇提鉛鹽沉淀法工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低，并使用有毒金屬鉛，可能對綠原酸產(chǎn)品造成一定的污染;超聲波法限于設(shè)備規(guī)模，放大到工業(yè)生產(chǎn)還存在困難;超濾法對提取液預(yù)處理要求高，產(chǎn)量易受超濾條件的影響，而且膜清洗麻煩;超臨界CO2萃取法和酶法的生產(chǎn)成本較高，目前不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

近年來，使用微波加熱輔助提取植物成分的技術(shù)越來越受到人們的重視。與傳統(tǒng)方法比較，微波輔助萃取具有提取效率高、溶劑使用少、可保護不耐熱成分等優(yōu)點，已經(jīng)在食品資源有效成分萃取中有較多的應(yīng)用，目前國內(nèi)已經(jīng)能生產(chǎn)工業(yè)化微波萃取設(shè)備［13－14］。本試驗研究用自制的回流式微波輔助萃取(Refluxing Microwave－Assisted Extraction，RMAE)裝置提取葵花籽粕中的綠原酸，確定最佳提取工藝條件并對提取的葵花籽粕綠原酸(Sunflower Seed Meal Chlorogenic Acid，SSMCA)進行抗氧化性能的初步測試。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葵花籽粕:新疆金新海油脂有限公司;綠原酸標樣(分析純):中國藥品生物制品鑒定所;無水乙醇(分析純):國藥集團化學試劑有限公司;1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH):Sigma－Aldrich中國有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

UV－1601紫外分光光度計:北京瑞利分析儀器公司;MG08S－2B微波實驗儀:南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司，本試驗中已經(jīng)對其進行了改造，安裝了冷卻回流裝置，并采用磁力攪拌裝置可在燒瓶中攪拌防止爆沸(圖1);HH－S2數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市醫(yī)療儀器廠;LD5－10B離心機:北京雷勃爾離心機有限公司。

圖1 回流式微波輔助萃取裝置示意圖

1.3 試驗方法

1.3.1 綠原酸的標準曲線制作

采用紫外可見分光光度計法測定綠原酸含量。選擇325 nm作為檢測波長，繪制標準曲線:準確稱取綠原酸標品1.30 mg，置于25 mL容量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻配置成標準溶液。準確吸取綠原酸標準溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 和6.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度。以50%乙醇為空白對照在波長325 nm下測定不同濃度綠原酸的吸光度。以綠原酸標品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 微波輔助提取的試驗步驟

粉碎:將葵花籽粕用粉碎機粉碎至40目的粉末，供微波萃取使用。

原料中綠原酸含量測定:稱取5 g粉碎的葵花籽粕，加入到盛有200 mL甲醇燒杯中，30℃密閉磁力攪拌提取一晝夜，過濾后將濾液離心，測定離心液體積和其中綠原酸含量，計算原料中綠原酸含量。

微波輔助提取:稱取12 g的粉碎后的葵花籽粕樣品，將其放入到萃取燒瓶中，然后加入500 mL一定體積分數(shù)的乙醇水溶液，將燒瓶接冷凝管后在微波條件下萃取，萃取結(jié)束后待其自然冷卻。

離心:冷卻后的料液用離心機離心，取上清液于燒杯中，封口。

分光光度法測定吸光值:將離心好的上清液在325 nm下測定吸光度，根據(jù)綠原酸標準曲線得出微波提取粗品中綠原酸的含量。按下式計算出綠原酸的得率。

1.3.3 微波輔助提取的單因素試驗

分別選取微波輔助提取時間、微波功率、料液比和乙醇體積分數(shù)進行單因素試驗。試驗中除所考察因素外，其他提取參數(shù)分別為提取時間20 min、微波功率390 W、料液比1∶15和乙醇體積分數(shù)50%。提取液冷卻后離心，測定上清液中綠原酸含量，計算綠原酸得率。每個試驗重復(fù)3遍，結(jié)果取平均值。

1.3.4 微波輔助提取的優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果確定正交優(yōu)化參數(shù)試驗的因素和水平進行正交試驗。每個試驗結(jié)束等料液冷卻后離心，測定上清液中綠原酸含量，計算綠原酸得率。每個試驗重復(fù)3遍，結(jié)果取平均值。

1.3.5 葵花籽粕綠原酸清除DPPH自由基能力的測定方法［15］

將在優(yōu)化提取的條件下得到的葵花籽粕綠原酸產(chǎn)品用雙蒸水稀釋成不同的濃度梯度，各取2 mL于試管中，再加入2 mL 0.04 mg/mL的DPPH溶液，混合均勻，反應(yīng)20 min，3 500 r/min離心分離10 min，取上清液在517 nm處測其吸光值為Ai;另各取2 mL上述濃度的綠原酸產(chǎn)品于試管中，分別加入無水乙醇2 mL，反應(yīng)20 min，3 500 r/min離心分離10 min，取上清液在517 nm處測其吸光值記為Aj;以2 mL 0.04 mg/mL DPPH和2 mL無水乙醇反應(yīng)液做為參比，其吸光值記為A0。按照下式計算葵花籽粕綠原酸對DPPH自由基的清除率E(DPPH):

E(DPPH)=［1－(Ai－Aj)/A0］×100%

式中:A0為2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇的吸光值;Ai為2 mL DPPH溶液+2 mL樣品的吸光值;Aj為2 mL無水乙醇+2 mL樣品的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標準曲線的制作及葵花籽粕中綠原酸含量的測定

按照1.3.1的方法繪制得到綠原酸標準曲線，如圖2所示。

圖2 綠原酸標準曲線

據(jù)標準曲線可以得到綠原酸濃度的回歸方程式:c=(A+0.010 6)/0.069 7，式中:c為綠原酸質(zhì)量濃度/mg/L;A為吸光度。

根據(jù)標準曲線，按1.3.2中的方法測定得到本試驗原料葵花籽粕中綠原酸質(zhì)量分數(shù)為2.23%。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 微波輔助提取時間對綠原酸得率的影響

葵花籽粕綠原酸得率隨微波輔助提取時間的變化如圖3所示。從圖3可以看出，在提取開始的20 min時間內(nèi)，綠原酸得率隨提取時間延長顯著增加，在20至30 min維持不變，提取時間達到60 min時得率略有降低。上述試驗結(jié)果表明，提取20 min左右之后再延長時間對得率的提高沒有幫助，而時間太長(如提取60 min)造成得率下降可能是由于綠原酸在微波作用或加熱條件下發(fā)生部分降解。根據(jù)試驗結(jié)果，將提取時間定為20 min，在提取參數(shù)優(yōu)化試驗中按此條件進行試驗。

圖3 微波輔助提取時間對葵花籽粕綠原酸得率的影響

2.2.2 微波功率對綠原酸得率的影響

圖4 微波輔助提取功率對葵花籽粕綠原酸得率的影響

圖4 結(jié)果表明，微波功率在190～520 W范圍中，綠原酸得率隨微波功率增加而提高，當微波功率大于520 W時綠原酸得率無顯著改變。一般來說，微波保持較高的功率時，細胞壁在微波作用下破裂更快，細胞內(nèi)物質(zhì)更容易溶解到溶劑中，因而提取效率更高;但當細胞壁在高功率微波作用下破碎程度很高時，再增加微波功率對提取效率影響有限。根據(jù)本試驗結(jié)果，可以選擇390、455和520 W作為正交試驗中功率因素的3個試驗水平。

2.2.3 料液比對綠原酸得率的影響

葵花籽粕與乙醇溶液料液比對綠原酸提取得率的影響如圖5所示。從圖5可以看出，綠原酸得率隨提取溶劑所占比例增大而提高，特別是料液比在1∶6至1∶12范圍內(nèi)時，溶劑比例增加對綠原酸得率的影響更顯著。在使用溶劑提取的方法中，較高比例的溶劑體積對于固體基質(zhì)的提取更有效，但考慮到實際生產(chǎn)中后續(xù)加工需要將溶劑蒸發(fā)掉，需要耗費大量能源，因此一般不能僅依據(jù)產(chǎn)品得率選擇料液比?？紤]以上情況，在后面的提取參數(shù)優(yōu)化試驗中對料液比因素選擇1∶12、1∶15和1∶18為3個試驗水平。

圖5 料液比對葵花籽粕綠原酸得率的影響

2.2.4 乙醇體積分數(shù)對綠原酸得率的影響

如圖6所示，不同的乙醇體積分數(shù)提取時綠原酸的得率不同，乙醇體積分數(shù)在40%以下時綠原酸得率隨體積分數(shù)的增大明顯升高，在40%以上隨體積分數(shù)增加而減小。這是由于溶劑不同的介電性能及極性而造成的。40%體積分數(shù)的乙醇對葵花籽粕綠原酸的溶出性能在所試驗的范圍內(nèi)是較好的。

圖6 乙醇體積分數(shù)對葵花籽粕綠原酸得率的影響

2.3 提取條件的優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇微波功率、料液比、乙醇體積分數(shù)3個因素進行正交試驗，提取時間為20 min。試驗因素水平和試驗結(jié)果分別如表1和表2所示。

表1 正交試驗因素和水平

表2 正交試驗結(jié)果

由表2看出，料液比對得率影響最大，其次是乙醇體積分數(shù)和微波功率。極差分析的結(jié)果表明，綠原酸的最佳提取工藝為:A1B3C2，即微波輻射功率為390 W，乙醇體積分數(shù)為35%，料液比為1∶18，在此條件下綠原酸得率為2.11%，前面研究中測定原料綠原酸質(zhì)量分數(shù)為2.23%，因此微波輔助提取優(yōu)化條件下葵花籽粕綠原酸提取率達到94.6%，考慮到提取時間僅為20 min，微波輔助提取效率綠原酸具有很高的效率。

2.4 葵花籽粕綠原酸清除DPPH自由基的能力測定

按照1.3.3的方法測定得到葵花籽粕綠原酸清除DPPH自由基的性能，結(jié)果如圖7所示。由圖可以看出，葵花籽粕綠原酸在1.0 mg/mL至7.0 mg/mL范圍對DPPH自由基表現(xiàn)出較強的清除效果，且綠原酸濃度與DPPH清除率呈線性關(guān)系，葵花籽粕綠原酸對DPPH自由基的半數(shù)影響濃度(median effective concentration，EC50值)為 2.6 mg/L。據(jù)文獻資料報道金銀花中綠原酸對DPPH自由基清除率為74%時所需質(zhì)量濃度為100 mg/L［16］，而根據(jù)圖7回歸方程式計算得，葵花籽粕綠原酸樣品對自由基清除率74%時的質(zhì)量濃度僅為5.8 mg/L，可見本試驗從葵花籽粕提取的綠原酸產(chǎn)品有較高的抗氧化性能，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖7 葵花籽粕綠原酸對DPPH自由基的清除作用

3 結(jié)論

本研究采用微波輔助回流的方式提取葵花籽粕中的綠原酸，通過對提取過程參數(shù)進行單因素試驗和優(yōu)化試驗，確定最終提取條件為:料液比為1∶18、微波輻射功率390 W、乙醇體積分數(shù)為35%、提取時間20 min，在此條件下綠原酸得率為2.11%，提取率達到94.6%。本研究的微波輔助回流提取僅用20 min，大大縮短提取時間，對提高生產(chǎn)效率有明顯的價值。經(jīng)測定，葵花籽粕綠原酸對DPPH自由基有明顯清除作用。

［1］鄧本興，張維剛，陳敬歡，等.葵花籽粕中提取綠原酸的工藝優(yōu)化［J］.廣東化工，2011，38(9):11 －13，18

［2］任健，鄭喜群，劉曉蘭，等.葵花蛋白的分離及特性研究［J］.中國糧油學報，2008，23(3):100 －103

［3］何榮海，王婷，楊進妹，等.葵花籽粕酶解制備低鈉鹽ACEI抑制肽［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(4):59－63

［4］PedrosaM，Muzquiz M，Garca － Vallejo C，et al.Determination of caffeic and chlorogeinc acids and their derivatives in different sunflower seeds［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80(4):459 －464

［5］高錦明，張鞍靈，趙曉明，等.綠原酸分布、提取與生物活性研究綜述［J］.西北林學院學報，1999，14(2):73 －82

［6］林緞常，宋勁詩，吳應(yīng)，等.金銀花中綠原酸的提取工藝探討［J］.中成藥，1994，16(7):16 －17

［7］陽元娥，譚偉.超聲提取葵粕綠原酸研究［J］.聲學技術(shù)，2008，27(1):53 －57

［8］周貴新.用超臨界二氧化碳從杜仲葉中提取有效成分的方法:中國，99114969.6［P］.2000－01－19

［9］楊祖金，江燕斌，葛發(fā)歡.超濾膜技術(shù)分離杜仲葉綠原酸的研究［J］.中藥材，2008，31(4):585－588

［10］陳永勝，李志光，董建國.酶解法提取葵花粕綠原酸工藝研究［J］.食品科學，2008，29(2):202－204

［11］龐利蘋，徐雅琴.微波輔助萃取法提取南瓜籽中植物甾醇工藝的優(yōu)化［J］.中國糧油學報，2010，25(8):47－50

［12］吳峰華，羅自生，何志平，等.山核桃外果皮總酚的微波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化研究［J］.中國糧油學報，2011，26(8):109 －113，122

［13］AmarowiczR，Naczk M，Shahidi F.Antioxidant activity of various fractions of non － tanin phenolics of canola hulls［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(7):2755－2759

［14］烏蘭.金銀花中綠原酸的提取及抗氧化性的研究［D］.天津:天津科技大學，2005.

Study on Refluxing Microwave－Assisted Extraction of Chlorogenic Acid from Sunflower Seed Meal

He Ronghai1Zhai Qingjiao1Zhong Hanshi2Liu Lei1
Jiang Bian1Liao Yan1Ma Haile1
(School of Food and Biological Engeering at JiangSu University Jiangsu Key Laboratory of Agricultural Product Physical Processing1，Zhenjiang 212013)
(School of Food Science and Engineering at Northwest A ＆ F University2，Yangling 712100)

Refluxing microwave－assisted extraction(RMAE)of chlorogenic acid from sunflower seed meal(SSM)was investigated in this study.Effects of SSM to solvent ratio，microwave power，ethanol concentration and extraction time on the yield of sunflower seed meal chlorogenic acid(SSMCA)were investigated by single factor tests，respectively.Based on result of single factor tests，orthogonal test of SSMCA extraction was explored in this study.And the optimal extraction parameters were decided by orthogonal test as follows:SSM to solvent ratio 1∶18，microwave power 390 W，ethanol concentration 35%and extraction time 20 min.At this extraction condition，the extraction rate and the yield of chlorogenic acid are 94.6%and 2.11%，respectively.SSMCA shows remarkable scavenging effect on 1，1 －Diphenyl－2 － picrylhydrazyl(DPPH)free radical，and its median effective concentration(EC50value)is 2.6 mg/L.

sunflower seed meal，chlorogenic acid，refluxing microwave － assisted extraction

TS201.1

A

1003－0174(2012)09－0107－05

高等學校博士學科點專項科研基金(2009322712 0012)，中國博士后基金(201004 71386)，江蘇省博士后基金(0902029C)，江蘇省科技支撐計劃(BE2011 401)，江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目(一期省屬高校016)

2011－12－28

何榮海，男，1971年出生，博士，副教授，食品物理加工技術(shù)