李 美 邵鄰相 徐玲玲 成文召 高海濤 丁 晴

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

野胡蘿卜花揮發(fā)油成分分析及生物活性研究

李 美 邵鄰相 徐玲玲 成文召 高海濤 丁 晴

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

分析野胡蘿卜花揮發(fā)油的成分及檢測(cè)其生物活性。采用GC/MS分析野胡蘿卜花揮發(fā)油的成分，比濁法檢測(cè)細(xì)菌活性，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。從野胡蘿卜花揮發(fā)油中鑒定出31種化合物，以β－紅沒(méi)藥烯為主要成分，占到63.06%。高質(zhì)量濃度(30 g/L)的野胡蘿卜花揮發(fā)油作用鮑曼不動(dòng)桿菌24 h的抑制率為33.12%。野胡蘿卜花揮發(fā)油作用人肝癌 HuH7 細(xì)胞 6、12、24 h 的 IC50分別是 122.99、132.25、46.20 mg/L，作用人肺癌 NCI－H446 細(xì)胞6、12、24 h 的 IC50是244.82、113.13、61.76 mg/L。野胡蘿卜花揮發(fā)油主要成分是 β －紅沒(méi)藥烯等萜類化合物，具有抗菌抑癌的作用。

野胡蘿卜 揮發(fā)油 GC/MS 抑菌活性 抑癌活性

近年來(lái)，植物揮發(fā)油因具有多種生物活性［1－4］而備受關(guān)注。野胡蘿卜(Daucus carota Linn.)，又名鶴虱草，山蘿卜，在我國(guó)各省均有分布。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，野胡蘿卜揮發(fā)油具有改善認(rèn)知功能障礙［5］、毒殺蚊幼蟲(chóng)［6］、抑菌［7］的作用。Staniszewska 等［8］研究表明枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌對(duì)野胡蘿卜揮發(fā)油敏感，而銅綠假單胞菌、擴(kuò)展青霉菌則不敏感。Rossi等［9］研究表明野胡蘿卜揮發(fā)油對(duì)空腸彎曲菌的生長(zhǎng)有抑制作用，甲基異丁香酚和欖香烯是其主要抑菌成分。除此之外，野胡蘿卜揮發(fā)油還有抗腫瘤活性，Zeinab等［10］研究表明其能抑制藥物誘發(fā)的小鼠皮膚乳頭狀瘤生長(zhǎng)。但有關(guān)野胡蘿卜揮發(fā)油體外抑制癌細(xì)胞作用方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在分析野胡蘿卜花揮發(fā)油化學(xué)成分，研究其對(duì)體外菌株和癌細(xì)胞增殖的影響，為野胡蘿卜的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮑曼不動(dòng)桿菌:浙江金華市中心醫(yī)院;人肺癌NCI－H446和肝癌HuH7細(xì)胞:中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所;新生牛血清:杭州四季青生物工程有限公司;DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶:Gibco公司;吐溫－80、二甲基四氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO):Sigma公司。

QP5050A型氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀:日本島津公司;3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、1500型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀:美國(guó)熱電公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野胡蘿卜花揮發(fā)油的提取

取野生的野胡蘿卜花晾干、粉碎后，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾滅菌后，以吐溫－80為助溶劑采用文獻(xiàn)［11］的方法配成母液放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GC/MS 分析條件

色譜柱:VF－Wax石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);初始溫度:60 ℃(保持2 min)升至250℃(保持10 min);升溫速度:15℃/min;汽化溫度:230℃;載氣(流量):He(1.0 mL/min);分流比:200∶1;進(jìn)樣量:1.0 μL。

質(zhì)譜檢測(cè)器:EI電離源、源溫200℃、電離電壓70 eV;質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù):NIST庫(kù)。

1.2.3 比濁法測(cè)定揮發(fā)油的抗菌活性

96孔板每孔接種濃度為2×103個(gè)/mL菌液100 μL，然后加入不同濃度的揮發(fā)油溶液100 μL，使其質(zhì)量濃度分別為0、10、15、30 g/L。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，酶標(biāo)儀600 nm下測(cè)定OD值。以僅加培養(yǎng)基的孔調(diào)零，并設(shè)置溶劑吐溫－80組，每組設(shè)4個(gè)平行孔，按下式計(jì)算抑菌率。抑菌率=(吐溫－80組OD值－試驗(yàn)組OD值)/吐溫－80組OD值×100%。

1.2.4 MTT檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的濃度，每孔90 μL接種到96孔板中。接種12 h后，再加入90 μL 揮發(fā)油溶液，使其質(zhì)量濃度分別為0、12.5、25、50、100、200、400 mg/L。分別繼續(xù)培養(yǎng) 6、12、24 h后，加入5 mg/mL的MTT 20 μL。待反應(yīng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加150 μL DMSO，避光振蕩15 min，至結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。以加等體積培養(yǎng)基處理的孔調(diào)零，并設(shè)置溶劑吐溫－80組，每組設(shè)6個(gè)平行孔，按下式計(jì)算抑制率。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(吐溫－80組OD值－試驗(yàn)組OD值)/吐溫－80組OD值×100%。1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用 Microsoft Excel和 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以珋x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 野胡蘿卜花揮發(fā)油成分分析結(jié)果

野胡蘿卜花揮發(fā)油經(jīng)GC/MS分析得到總離子流圖，如圖1所示。結(jié)果共檢出31種成分，主要為萜類化合物，占總峰面積的的99.97%。其中共分離得到倍半萜及其衍生物14種，占總揮發(fā)油的80.88%;單萜及其衍生物共14種，占4.85%;除此之外的3種化合物占14.24%。從表1中可以看出野胡蘿卜花揮發(fā)油的主要化學(xué)成分為萜烯類化合物，含量最高的是β－紅沒(méi)藥烯(β－Bisabolene)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.06%。其次是13.65%的 α－細(xì)辛腦(α－Asarone)，5.71%的4(14)，11 － 桉葉二烯(Eudesma－4(14)，11 － diene)，5.26% 的 Z，Z，Z －1，5，9，9 － 四甲基 －1，4，7，－ 環(huán)十一(1，4，7 － Cycloundecatriene，1，5，9，9 － tetramethyl－ ，Z，Z，Z － )，2.55%的 1R －α－蒎烯(1R－α－pinene)，2.21%的胡蘿卜次醇(Carotol)。石竹烯(Caryophyllene)和β－倍半水芹烯(β－Sesquiphellandrene)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在1%以上。

圖1 野胡蘿卜花揮發(fā)油化學(xué)成分總離子流圖

表1 野胡蘿卜花揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量

2.2 野胡蘿卜花揮發(fā)油對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌增殖的影響

野胡蘿卜花揮發(fā)油對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌增殖的影響見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組相比，試驗(yàn)組與吐溫－80組的OD值均顯著減小(P＜0.05)。所以計(jì)算抑菌率時(shí)，以吐溫－80組為對(duì)照。與吐溫－80組相比，30 g/L野胡蘿卜花揮發(fā)油組OD值顯著減小(P＜0.05)。經(jīng)計(jì)算，質(zhì)量濃度為 10，15，30 g/L 的野胡蘿卜花揮發(fā)油作用鮑曼不動(dòng)桿菌24 h后，抑制率分別為 1.85%，12.10%，33.12%?？梢钥闯?，濃度低的野胡蘿卜花揮發(fā)油對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的增殖無(wú)影響，濃度高時(shí)可以抑制其增殖。

表2 野胡蘿卜花揮發(fā)油對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌增殖的影響(珋x±s，n=4)

2.3 野胡蘿卜花揮發(fā)油對(duì)癌細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，野胡蘿卜花揮發(fā)油質(zhì)量濃度為12.5，25，50，100，200，400 mg/L 時(shí)，其作用人肺癌HuH7細(xì)胞 12 h后的抑制率分別為 24.35%，23.67%，31.06%，52.42%，76.09%，93.82%。100 mg/L的揮發(fā)油作用HuH7細(xì)胞6，12，24 h后的抑制率為48.48%，52.42%，97.13%。隨著濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率均增大。

圖2 野胡蘿卜花揮發(fā)油對(duì)人肝癌HuH7細(xì)胞增殖的抑制作用

從圖3可以看出，野胡蘿卜花揮發(fā)油作用NCIH446細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)出同樣的規(guī)律。野胡蘿卜花揮發(fā)油作用人肝癌HuH7細(xì)胞6、12、24 h的 IC50分別是122.99、132.25、46.20 mg/L，其作用人肺癌 NCI －H446 細(xì)胞 6、12、24 h 的 IC50分別是 244.82、113.13、61.76 mg/L。

圖3 野胡蘿卜花揮發(fā)油對(duì)人肺癌NCI－H446細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果表明，野胡蘿卜花揮發(fā)油能夠抑制人肺癌NCI－H446和肝癌HuH7癌細(xì)胞的增殖，并表現(xiàn)出一定的時(shí)間和濃度依賴性。

3 討論與結(jié)論

野胡蘿卜花揮發(fā)油的主要成分為β－紅沒(méi)藥烯、α －細(xì)辛腦、4(14)，11 － 桉葉二烯、Z，Z，Z －1，5，9，9－四甲基－1，4，7，－環(huán)十一碳三烯、蒎烯、胡蘿卜次醇、石竹烯，其中4(14)，11 － 桉葉二烯和 Z，Z，Z－1，5，9，9 －四甲基 －1，4，7，－ 環(huán)十一碳三烯尚屬野胡蘿卜揮發(fā)油中首次報(bào)道。文獻(xiàn)報(bào)道的野胡蘿卜揮發(fā)油的主要成分欖香烯、芹子烯、大根香葉烯，未在樣品中檢出［9，12－13］。野胡蘿卜花揮發(fā)油中含量最高是β－紅沒(méi)藥烯，與湖北產(chǎn)的南鶴虱揮發(fā)油相似［12］。樣品的產(chǎn)地、采收季節(jié)及貯藏條件的不同，或測(cè)試條件的不同，可能造成野胡蘿卜揮發(fā)油的主要成分存在上述差異。野胡蘿卜花揮發(fā)油中的α－細(xì)辛腦具有降血脂、利膽、止咳的功效［14］，蒎烯具有抑菌的活性［15］。

抑菌試驗(yàn)表明，低濃度野胡蘿卜花揮發(fā)油對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌增殖的影響不明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度大于15 g/L時(shí)表現(xiàn)出抑菌作用。野胡蘿卜花揮發(fā)油質(zhì)量濃度大于200 mg/L時(shí)對(duì)HuH7和NCI－H446細(xì)胞的抑制率均大于50%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑癌活性。揮發(fā)油作為典型的親脂性物質(zhì)，可以破壞細(xì)胞膜，引發(fā)膜內(nèi)一系列的改變，影響細(xì)菌、細(xì)胞正常的增殖，表現(xiàn)出一定的抗菌抑癌活性。

野胡蘿卜花揮發(fā)油的主要成分是萜類化合物，具有抗菌抑癌的作用。本試驗(yàn)為野胡蘿卜的開(kāi)發(fā)利用以及野胡蘿卜揮發(fā)油的臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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Study on Constituents and Biological Activity of Volatile Oil from Umbels of Daucus Carota Linn

Li Mei Shao Linxiang Xu Lingling Cheng Wenzhao Gao Haitao Ding Qing
(College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004)

To analyse constituents and determine the biological activity of the volatile oil from umbels of daucus carota linn.，chemical constituents was analyzed by GC/MS，the vitality of bacteria was assayed with nephelometry method and the vitality of cancer cell was evaluated by MTT assay.31 compositions were identified and the mian compound was β － bisabolene accounting for 63.06%of the total oil.The inhibition rate of the oil against acinetobacter baumanii for 24 h was 33.12%at high concentration of 30 g/L.The IC50of the oil on hepatocellular carcinoma HuH7 cells for 6，12，24 h were 122.99，132.25，46.20 mg/L and the IC50on human lung cancer cell line NCI－ H446 were 244.82，113.13，61.76 mg/L.The mian constituents of volatile oil from umbels of daucus carota linn.were terpenes such as β － bisabolene and the oil had antibacterial and anticancer activities.

daucus carota linn，volatile oil，GC/MS，antibacterial activity，anticancer activity

Q949.95

A

1003－0174(2012)09－0112－04

2011－12－12

李美，女，1985年出生，碩士，細(xì)胞生物學(xué)

邵鄰相，男，1962年出生，教授，碩士生導(dǎo)師，細(xì)胞生物學(xué)