郭宏華 劉 娟 劉百歌 張曉靜 晁 陽 何成彥 張學(xué)英

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033)

單增李斯特菌是李斯特菌屬中致病性最強(qiáng)的，是人類最重要的食源性病原菌〔1〕，也是引起人類和動(dòng)物李斯特菌病的主要致病菌，可造成多種動(dòng)物如豬、雞等畜禽死亡，人感染后可造成腦膜炎、新生兒敗血癥、早產(chǎn)、死胎、膿腫、心內(nèi)膜炎、單核細(xì)胞增多等疾病，死亡率很高，可高達(dá)30% ～40%〔2〕。近年來在世界上很多國家也報(bào)道了由于污染單增李斯特菌而發(fā)生的食物中毒事件〔3〕。因此，建立LM的快速檢測(cè)方法，對(duì)人類健康和食品生產(chǎn)具有重要意義和應(yīng)用前景。目前單增李斯特菌的檢測(cè)主要依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定，需要的時(shí)間長，檢出率較低〔4〕;其他檢測(cè)方法如PCR方法、基因探針等都存在特異性不足〔5〕。本實(shí)驗(yàn)擬改進(jìn)該菌的檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性、靈敏度、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料 單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌種(54001、54002株)購于北京鼎國生物制劑公司，實(shí)驗(yàn)室低溫保存;小鼠骨髓瘤NS-1細(xì)胞，吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存，BALB/C小鼠由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物室提供。RPMI 1640、胎牛血清(GIBCO)，HAT、HT、PEG 4000(SIGMA)均購于大連寶生物制劑公司?？贵w亞類測(cè)定試劑盒為SIGMA公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌體表面抗原的提取 細(xì)菌接種于TSBYE培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h后，10 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗3次后，將菌體懸浮于SDS緩沖液中，在常溫下孵育1 h，10 000 r/min離心10 min，收集上清提取液，去離子水透析48 h，在595 nm處比色，得吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蛋白濃度，－80℃凍存。

1.2.2 動(dòng)物免疫方案 將收集培養(yǎng)的李斯特菌溶于生理鹽水中，經(jīng)甲醛固定，PBS洗6次，保存于－20℃?zhèn)溆谩Ｈ?×108溶于100 μl PBS中初次免疫小鼠，腹腔注射。1個(gè)月后進(jìn)行第二次免疫，菌體量同初次免疫;融合前3 d加強(qiáng)免疫，劑量減為原來的一半。

1.2.3 細(xì)胞融合

1.2.3.1 培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞NS-1 融合前骨髓瘤細(xì)胞用8-AG培養(yǎng)基篩選其活性。骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞在指數(shù)增長期狀態(tài)下進(jìn)行融合。

1.2.3.2 制備飼養(yǎng)細(xì)胞 將小鼠拉頸處死，用75%酒精浸泡3～4 min。用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔，用酒精棉消毒，用無菌注射器注入5～6 ml預(yù)冷的培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗，吸出沖洗液。沖洗液放入離心管中離心5～6 min，用20%小牛血清培養(yǎng)液混懸，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×105/ml，將細(xì)胞液接種于96孔板中。置37℃條件下培養(yǎng)。

1.2.3.3 脾細(xì)胞的制備 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠，拉頸處死。將小鼠放在75%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾，用血清培養(yǎng)液沖洗2次。把脾臟移入盛有無血清培養(yǎng)液的勻漿器中研磨，用無血清培養(yǎng)液沖洗，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中離心，去上清，懸浮于不完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞量。

1.2.3.4 細(xì)胞融合 取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按10∶1比例混合，在 50 ml離心管中用不完全培養(yǎng)液洗1次后經(jīng)1 000 r/min離心7 min，棄上清，吸凈殘留液體，輕彈離心管底使沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊略松動(dòng)，同時(shí)加入50%PEG 1 ml，1 min內(nèi)加完。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，停止PEG的作用。每隔2 min，勻速加入1 ml，直至加到10 ml，輕輕混勻，1 000 r/min離心6 min。去掉離心后融合細(xì)胞的上清液，用10%小牛血清培養(yǎng)液輕輕混懸，將融合細(xì)胞混合懸液加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，100 μl/孔，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.2.4 ELISA法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選培養(yǎng) 脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。雜交瘤細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)液中可以生長繁殖。前幾天用HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)融合細(xì)胞，第8天后每天半量換HAT培養(yǎng)液，維持10 d后換一般培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞鋪滿管底1/5時(shí)，開始檢測(cè)特異性抗體，用ELISA篩選出陽性克隆。

篩選方法：將每孔100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液加入到細(xì)菌表面抗原包被好的酶標(biāo)板上，同時(shí)以免疫小鼠血清為陽性對(duì)照(1∶1 000稀釋)、正常小鼠血清為陰性對(duì)照(1∶1 000稀釋)，每孔100 μl，37℃孵育1 h，PBS洗3次，加入 HRP酶標(biāo)記的兔抗鼠 IgG 100 μl，室溫孵育1 h;棄酶標(biāo)二抗，PBS洗4次;加底物顯色劑50 ml/孔，室溫避光反應(yīng)30 min;每孔加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng);酶標(biāo)儀OD450 nm處測(cè)定，測(cè)定值高于陰性對(duì)照3倍以上者為陽性。

1.2.5 陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 經(jīng)兩次檢測(cè)均為陽性的雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。克隆前1 d制備飼養(yǎng)細(xì)胞層(同細(xì)胞融合)，將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞為3～10個(gè)細(xì)胞/ml。取前一日準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100 μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。在第7天換液，以后每2～3 d換液1次。8～9 d可見細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測(cè)抗體活性。將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。每個(gè)克隆盡快凍存。

1.2.6 單克隆抗體的大量生產(chǎn) 取健康BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5 ml高壓滅菌的液體石蠟，10 d后往小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞。接種細(xì)胞10 d待小鼠腹部變大、瀕臨死亡時(shí)收集腹水至離心管中，1 500 r/min，離心10 min，吸取上清，去掉脂肪層分裝后貯存于－20℃冰箱，進(jìn)一步純化。

1.2.7 單克隆抗體的純化 收集到的小鼠腹水用飽和硫酸銨溶液滴加至溶液濃度為33%，過夜，離心，去上清，PBS透析除鹽。

1.2.8 單克隆抗體類和亞類的鑒定 離心處理樣品，用PBS按照1∶1 000比例稀釋腹水樣品和陰性對(duì)照品。取100 μl分別包被到ELISA板中，每種樣品一列，每列6個(gè)孔，取PBS為空白對(duì)照，酶標(biāo)板置于室溫1 h。用PBST洗板3次，分別加入同型試劑 IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3(Sigma公司生產(chǎn))，將每種亞型抗體分別加入到空白孔、陰性對(duì)照和腹水樣品孔中，每孔100 μl，室溫放置30 min。PBST洗板3次，每孔加入1∶500稀釋的HRP標(biāo)記的馬抗羊二抗(北京鼎國生物技術(shù)責(zé)任公司)，每孔100 μl，室溫放置15 min。PBST 洗板3 次，每孔加入底物液 100 μl，放置 10 min 后加 50 μl終止液，用酶標(biāo)儀在490 nm處讀數(shù)記錄。

1.2.9 雜交瘤細(xì)胞的核型分析 取處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，加入秋水仙素到培養(yǎng)液中，使其終濃度為0.5 μg/ml，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，將37℃預(yù)溫0.075 mol/L的KCL溶液加入，放置培養(yǎng)箱中靜置20～30 min。往細(xì)胞懸液中加入新鮮配制的醋酸-甲醇固定液1 ml，用吸管輕輕吹打，1 000 r/min離心5 min。把上清液棄去，緩慢加入新鮮固定液5 ml，用吸管輕輕吹打，靜置20～30 min，1 000 r/min離心5 min，吸出大部分上清，留1 ml左右。取2～3滴細(xì)胞懸液，從較高處距離向預(yù)冷的載玻片滴加，在室溫中自然干燥。常規(guī)Giemsa染色，鏡下計(jì)數(shù)染色體。

2 結(jié)果

2.1 抗單核李斯特菌單克隆抗體特異性的鑒定 共進(jìn)行10次細(xì)胞融合，融合率為32%(1 065/3 360)。通過初篩，與單增李斯特菌呈強(qiáng)陽性反應(yīng)、大腸埃希菌呈陰性反應(yīng)孔為193孔。進(jìn)一步鑒定此193個(gè)樣品與下表所列菌種的反應(yīng)性，篩選出與其無交叉反應(yīng)的產(chǎn)抗單核李斯特菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2F5、5H1 和8F9。

2.2 雜交瘤細(xì)胞的核型 篩選出的產(chǎn)抗單核李斯特菌單克隆抗體的細(xì)胞系2F5、5H1和8F9，經(jīng)常染色體染色可見染色體數(shù)顯著增加，為雜交瘤細(xì)胞。見圖1。

圖1 雜交瘤細(xì)胞核型

2.3 單克隆抗體類與亞類 經(jīng)間接ELISA方法測(cè)定，2F5、5H1和8F9單克隆抗體類型分別為IgG2b、IgG3、IgM，檢測(cè)樣品OD490值分別為 0.742、1.072、2.064。

3 討論

李斯特菌在上世紀(jì)90年代被列為4大重要的致病菌之一〔6〕。WHO食品安全工作計(jì)劃已將單增李斯特菌列為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的食源性病菌之一〔7，8〕。目前，檢測(cè)單增李斯特菌傳統(tǒng)的方法是分離培養(yǎng)和生化鑒定，檢測(cè)時(shí)間長，靈敏度不高，不利于疾病的預(yù)防和控制。所以，為了改進(jìn)單增李斯特菌的檢測(cè)方法，建立對(duì)該菌快速檢測(cè)是很必要的。

本研究利用產(chǎn)單核李斯特菌菌體蛋白免疫動(dòng)物Balb/c小鼠，多次反復(fù)經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射，每次注射應(yīng)定量，并注重接種的時(shí)間間隔，適當(dāng)添加弗氏佐劑。經(jīng)過一段時(shí)間的飼養(yǎng)后，選擇血清抗體滴度高的接種動(dòng)物，在無菌情況下處死，取出脾臟剪碎、分離、離心取其懸浮細(xì)胞置入培養(yǎng)皿中，備用。再另取純系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞放進(jìn)培養(yǎng)皿中，加入一些飼養(yǎng)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)促使其生長，在該混合液中有多種細(xì)胞。經(jīng)過細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，提取目的細(xì)胞——雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行HAT選擇培養(yǎng)獲得純代雜交瘤細(xì)胞。在眾多的雜交瘤細(xì)胞中，有的不表達(dá)免疫球蛋白，有的表達(dá)其他類型的球蛋白。因此，要用特異性的檢測(cè)方法——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)從眾多的細(xì)胞中篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞。有限稀釋法將目的雜交瘤細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞，讓其克隆化形成細(xì)胞株，再轉(zhuǎn)移至其他培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。為了大量地獲得抗體，還需要經(jīng)過小鼠腹腔接種，誘導(dǎo)小鼠腹水，然后從腹水中分離提純抗體。從小鼠腹水中獲取的單克隆抗體，通過親和層析方法進(jìn)行純化，可獲得純化的單克隆抗體，該抗體純度較好、效價(jià)較高。與過去傳統(tǒng)的方法比較，提高了實(shí)驗(yàn)方法的靈敏性、準(zhǔn)確性、特異性和標(biāo)準(zhǔn)化。

單克隆抗體只與抗原分子上某一個(gè)表位(即抗原決定簇)相結(jié)合，利用這一特性可把它作為研究工作中的探針，可以從分子、細(xì)胞和器官的不同水平上，研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并可從理論上闡明其機(jī)制。如用熒光物質(zhì)標(biāo)記單抗作為探針，能方便地確定與其結(jié)合的相應(yīng)生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、酶等)在細(xì)胞中的位置和分布。本研究旨在研制抗單增李斯特菌單克隆抗體，為今后進(jìn)一步檢測(cè)單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。

1 Yundong Chi-Zhang，Kit L Yam.Effective control of Listeriamonocytogenes by combination of nisin formulated and slowly released into a broth system〔J〕.Intern J Food Microbiol，2004;90：15-22.

2 熊國華，于 莉，曹際娟，等.單增李斯特菌免疫膠體金試紙條快速檢測(cè)〔J〕. 中國公共衛(wèi)生雜志，2008;24(2)：248-9.

3 王海燕，劉中學(xué)，劉 虹，等.視頻中單增李斯特菌快速、敏感、特異PCR檢測(cè)方法的建立〔J〕.檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2006;(1)：3-6.

4 吳清平，李善志，張菊梅，等.單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005;15(7)：888-90.

5 Becker B，Jordan S，Holzapf WH，et al.Rapid and specific detection of Listeria monocytogenes in smoked salmon with BAX2 PCR〔J〕.Food Cont rol，2005;16(8)：7172721.

6 陳道利，陶 勇，霍開蘭，等.直接入口食品中單核細(xì)胞李斯特菌污染調(diào)查及其檢驗(yàn)方法比較〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2003;8(4)：492-3.

7 李干紅，丁曉雯.李斯特菌及其快速檢測(cè)〔J〕.廣州食品工業(yè)科技，2002;18(3)：67-9.

8 周曉輝，焦新安.產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的分子鑒定與亞分型研究〔J〕. 中國人獸共患病雜志，2003;19(5)：44-7.