楊其亞，張紅印，龐水秀，靳莎莎

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

植酸結(jié)合膠紅酵母對(duì)桃果采后根霉病的控制

楊其亞，張紅印*，龐水秀，靳莎莎

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

為了尋找一種能夠代替化學(xué)殺菌劑控制桃果采后病害的方法，研究了植酸與膠紅酵母結(jié)合使用對(duì)桃果采后根霉病的控制效果。結(jié)果表明，0.15%植酸與膠紅酵母結(jié)合使用能顯著降低桃果采后根霉病發(fā)病率，防治桃果自然腐爛的發(fā)生，并且對(duì)果實(shí)貯藏品質(zhì)沒有產(chǎn)生不利影響；能誘導(dǎo)桃果多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性的提高，同時(shí)可以抑制丙二醛（MDA）含量的增加。

植酸，膠紅酵母，桃果，根霉病，控制

水果采后病害造成的損失是巨大的[1]，長期以來，世界上對(duì)水果病害包括采后病害的控制主要依賴于化學(xué)殺菌劑[2]，殺菌劑的長期和大量使用，嚴(yán)重污染環(huán)境，有損于人體健康。過去十多年，公眾和科學(xué)界對(duì)于食品和環(huán)境中農(nóng)藥（尤其殺菌劑）殘留問題的關(guān)注日益增加。近年來，我國政府對(duì)食品的安全性非常重視，各地都在推行放心菜、放心肉、放心水果工程，不使用化肥農(nóng)藥的綠色水果深受廣大消費(fèi)者歡迎。另外，我國已加入WTO，國外對(duì)水果上的農(nóng)藥殘留有嚴(yán)格的規(guī)定，特別是有些國家為了保護(hù)本國的經(jīng)濟(jì)利益，實(shí)行貿(mào)易壁壘，對(duì)水果上的農(nóng)藥和化學(xué)殺菌劑殘留實(shí)行近乎苛刻的規(guī)定。所有這一切都要求我們開發(fā)安全、無公害、高效的水果生物保鮮劑。生物保鮮劑既能減輕有害微生物對(duì)果蔬侵染，又能保護(hù)環(huán)境，是生產(chǎn)安全性食品的有效方法。膠紅酵母是被證明的能有效控制水果采后病害的酵母拮抗菌[3]，但其對(duì)水果采后病害的防治效力與化學(xué)殺菌劑相比仍有較大的差距，因此如何提高拮抗酵母菌的拮抗效力，是提高其對(duì)水果采后病害控制水平，并將其應(yīng)用于水果貯藏保鮮的重要策略之一。植酸作為一種從天然植物中提取的安全、多功能的新型食品添加劑，無致毒性，安全可靠，對(duì)果蔬具有良好的保鮮效果。本文研究了植酸結(jié)合膠紅酵母對(duì)桃果采后根霉病病害的抑制效果，對(duì)桃果自然腐爛及貯藏品質(zhì)的影響以及植酸增強(qiáng)膠紅酵母對(duì)桃果采后病害防治效力的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品 正常商業(yè)成熟度的桃（Prunus persica Batsch.）果實(shí)，品種為大久保，購買于江蘇省句容市，早晨采摘后立即運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇無機(jī)械損傷、未感染、大小和成熟度等外觀品質(zhì)基本一致的果實(shí)，分組待用；膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa） 本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，在250mL的三角瓶中裝入50mL的NYDB（牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，水1000mL）種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)接入兩環(huán)活化好的R.mucilaginosa，在200r/min，28℃條件下培養(yǎng)20h；將上述培養(yǎng)混合物在7000×g條件下，離心10min，無菌生理鹽水洗滌兩次，去除培養(yǎng)介質(zhì)，并用無菌生理鹽水重新懸浮酵母細(xì)胞，血球記數(shù)板調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×108cells/mL。在250mL的三角瓶中裝入50mL NYDB培養(yǎng)基，加入上述濃度的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液1mL（植酸含量分別為0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%），然后在200r/min，28℃條件下培養(yǎng)24h；上述不同處理酵母培養(yǎng)混合物在7000×g條件下，離心10min，并用無菌生理鹽水洗滌2次，去除培養(yǎng)介質(zhì)，再用無菌生理鹽水稀釋到所需濃度；匍枝根霉（Rhizopus stolonifer） 分離自腐爛的桃果果實(shí)，在PDA培養(yǎng)基（200g去皮馬鈴薯加水煮沸20min后過濾，濾液中加入20g葡萄糖，20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL）28℃下培養(yǎng)7d后，將其懸浮在無菌水中，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對(duì)病原菌孢子數(shù)目進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)需要用無菌水調(diào)節(jié)至所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度植酸對(duì)桃果根霉病采后病害的抑制效果 果實(shí)處理后，用消過毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面赤道部位形成5mm（直徑）×3mm（深）的傷口。每個(gè)傷口處等量加入30μL不同濃度的植酸溶液（0.05%～0.25%），3h后在每個(gè)傷口處加入30μL等量的病原菌孢子（R.stolonifer濃度為1×104spores/mL）。自然晾干后，將果實(shí)放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25℃，RH 95%）。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)12個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。經(jīng)過若干天的培養(yǎng)，計(jì)算發(fā)病率，以此評(píng)價(jià)不同濃度植酸的抑菌效果。

1.2.2 植酸結(jié)合膠紅酵母對(duì)桃果根霉病采后病害的抑制效果 果實(shí)處理后，用消過毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面赤道部位形成5mm（直徑）×3mm（深）的傷口。每個(gè)傷口處等量加入30μL溶液：a.1×108cells/mL的酵母菌（含0.05%～0.25%植酸）；b.1×108cells/mL的酵母菌；c.無菌水（作為對(duì)照）。3h后在每個(gè)傷口處加入30μL等量的病原菌孢子（R.stolonifer濃度為1×104spores/mL）。自然晾干后，將果實(shí)放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25℃，RH 95%）。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)12個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。經(jīng)過若干天的培養(yǎng)，計(jì)算發(fā)病率，以此評(píng)價(jià)膠紅酵母菌種（Rhodotorula mucilaginosa）的抑菌效果。

1.2.3 植酸與膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃果自然腐爛及貯藏品質(zhì)的影響 實(shí)驗(yàn)水果采摘后直接用以下處理浸泡果實(shí)30s：a.1×108cells/mL的酵母菌（含0.15%植酸）；b. 1×108cells/mL的酵母菌；c.0.15%植酸；d.無菌水（作為對(duì)照）。然后將果實(shí)放在塑料筐內(nèi)，風(fēng)干后用保鮮膜密封。貯藏于4℃冰柜，30d后轉(zhuǎn)入25℃培養(yǎng)箱貯藏，7d后觀察果實(shí)腐爛情況，計(jì)算腐爛率，并進(jìn)行貯藏品質(zhì)分析。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)10個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

貯藏品質(zhì)分析方法如下：采用稱重法測(cè)定失重；采用TA－XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)試硬度；參照Larrigaudière等的方法[4]測(cè)定總可溶性固形物；參照郝建軍等的方法[5]測(cè)定可滴定酸度；采用紫外快速測(cè)定法[6]測(cè)定維生素C的含量；采用改進(jìn)的Lee的方法[7]測(cè)定褐變度。1.2.4 植酸與膠紅酵母結(jié)合對(duì)果實(shí)抗性相關(guān)酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響 果實(shí)處理后，用消過毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面赤道部位形成5mm（直徑）×3mm（深）的傷口，每個(gè)傷口處等量加入30μL以下處理液：a.1×108cells/mL的酵母菌（含0.15%PA）；b.1× 108cells/mL的酵母菌；c.PA（0.15%）；d.無菌水。處理后果實(shí)放在塑料筐內(nèi)，用保鮮膜密封，25℃貯藏，并定期取樣對(duì)果實(shí)抗性相關(guān)酶活性及脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行測(cè)定。每處理重復(fù)3次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

酶液的提?。喝訒r(shí)先用無菌刀片刮去傷口表面組織，然后用9mm（直徑）×10mm（深）的打孔器從6個(gè)果實(shí)傷口處取2g的新鮮果肉組織置于預(yù)冷的研缽中。加入10mL 4℃預(yù)冷的50mmol/L含1.33mmol/L EDTA和1%PVPP的提取緩沖液。加入少量石英砂在冰浴中充分碾磨，破碎組織，12000×g，4℃條件下離心10min，取上清液作為酶活性等指標(biāo)樣品。每個(gè)處理重復(fù)3次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

PPO活性測(cè)定采用鄰苯二酚法[8]，POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[9]，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測(cè)定參照Du和Bramlage的方法[10]，略有改動(dòng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS/PC統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行鄧肯式多重比較差異分析（取P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度植酸對(duì)桃果根霉病的抑制效果

如圖1所示，與對(duì)照組相比，植酸單獨(dú)使用可以降低桃果由匍枝根霉引起的根霉病的發(fā)病率，且0.15%植酸對(duì)桃果傷口根霉病侵染的抑制效力最為顯著。

圖1 不同濃度植酸對(duì)桃根霉病的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of different concentration phytic acid on peaches Rhizopus decay

2.2 植酸與膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃果根霉病的抑制效果

如圖2所示，與對(duì)照組相比，膠紅酵母單獨(dú)使用可以降低桃果由匍枝根霉引起的根霉病的發(fā)病率，且膠紅酵母與0.15%植酸結(jié)合使用對(duì)桃果傷口根霉病侵染的抑制效力顯著增強(qiáng)。經(jīng)膠紅酵母與0.15%植酸結(jié)合處理的桃果，其根霉病發(fā)生率僅為對(duì)照組的30.5%，為膠紅酵母單獨(dú)處理的57.9%。當(dāng)植酸濃度為0.05%、0.1%、0.2%、0.25%與膠紅酵母結(jié)合使用，與酵母單獨(dú)使用并沒有顯著差異。

圖2 不同濃度植酸與膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃根霉病的抑制效果Fig.2 Inhibition effect of different concentration phytic acid combination with Rhodotorula mucilaginosa on peaches Rhizopus decay

2.3 植酸與膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃果自然腐爛及貯藏品質(zhì)的影響

如圖3所示，0.15%植酸結(jié)合膠紅酵母處理對(duì)桃果自然腐爛的抑制作用顯著，其處理的桃果自然腐爛率約為膠紅酵母單獨(dú)處理的桃果腐爛率的71.4%。同時(shí)，如表1所示，與對(duì)照組桃果相比，經(jīng)0.15%植酸與膠紅酵母結(jié)合處理的桃果其硬度、可溶性固形物含量無顯著差異，VC含量顯著增加，失重率及褐變度顯著降低，對(duì)各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)均不產(chǎn)生有害影響。

圖3 植酸與膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃果自然腐爛的抑制效果Fig.3 Effect of R.mucilaginosa combination with PA treatment on natural rotten percent of peach fruits

2.4 植酸結(jié)合膠紅酵母對(duì)桃果抗病性酶活及脂質(zhì)過氧化作用的影響

2.4.1 對(duì)桃果POD活性的影響 過氧化物酶（POD）能夠氧化自由基和活性氧，所以常作為植物抗氧化脅迫的重要指標(biāo)。POD是多功能酶，在果實(shí)衰老和抗性生理中都具有重要調(diào)節(jié)作用，高POD活性被認(rèn)為是植物果實(shí)抗性誘導(dǎo)的一個(gè)生理生化標(biāo)志。從圖4可以看出，膠紅酵母單獨(dú)處理和與植酸結(jié)合處理的桃果POD活性從開始就快速上升，在第2d達(dá)到最高值，結(jié)合處理的桃果POD活性除第2d時(shí)稍低于膠紅酵母單獨(dú)處理，其余都高于其它幾種處理。植酸單獨(dú)處理和對(duì)照處理的桃果POD活性變化不大。膠紅酵母單獨(dú)處理和與植酸結(jié)合處理的桃果POD活性與對(duì)照相比，顯著提高了傷口組織中POD的活性。

圖4 植酸和膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃果POD活性的影響Fig.4 Effect of R.mucilaginosa and PA on POD activity of peach

圖5 植酸和膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃果PPO活性的影響Fig.5 Effect of R.mucilaginosa and PA on PPO activity of peach

表1 植酸與膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃果儲(chǔ)藏品質(zhì)的影響Table 1 Effect of R.mucilaginosa and PA treatments on quality parameters of intact peach fruits

2.4.2 對(duì)桃果PPO活性的影響 多酚氧化酶（PPO）可催化木質(zhì)素及其他酚類氧化產(chǎn)物的形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而抵抗病菌的入侵，也可以通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用。酚類物質(zhì)在植物抗病機(jī)理中具有重要作用，多酚氧化酶（PPO）催化酚類物質(zhì)形成對(duì)病原菌更具毒性的醌[11]。增強(qiáng)的PPO活性與植物抗病性相關(guān)[12-13]。從圖5可以看出，各個(gè)處理的桃果實(shí)PPO含量整體呈先上升后下降趨勢(shì)。膠紅酵母與植酸結(jié)合處理桃果傷口的PPO活性迅速增加，在第2d時(shí)達(dá)到最大值，是對(duì)照處理的1.32倍。膠紅酵母單獨(dú)處理在第2d達(dá)到最大值后保持穩(wěn)定狀態(tài)。植酸單獨(dú)處理在第2d時(shí)PPO活性最大且含量接近膠紅酵母單獨(dú)處理的。對(duì)照處理的PPO活性在第2d達(dá)到最大值后迅速下降，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段對(duì)照處理的PPO活性都是最低。膠紅酵母與植酸結(jié)合處理的PPO含量除第0d與對(duì)照處理無顯著差異，其余時(shí)間都顯著高于對(duì)照。2.4.3 對(duì)桃果MDA含量的影響 植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是多不飽和脂肪酸的分解產(chǎn)物，會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷生物膜，通常利用它作為脂質(zhì)過氧化作用的生物標(biāo)記，MDA含量可以反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度和植物衰老指標(biāo)及對(duì)逆境條件的反應(yīng)的強(qiáng)弱。從圖6可以看出，膠紅酵母單獨(dú)處理的、膠紅酵母與植酸結(jié)合處理和植酸單獨(dú)處理桃果的MDA含量在第1d下降到最低后逐漸上升，而對(duì)照處理桃果傷口處MDA含量在第1d先稍微下降，然后上升，在第2d達(dá)到最大值。膠紅酵母與植酸結(jié)合處理除在第0d外，都處于較低水平，且一直都低于對(duì)照，顯著抑制了桃果果實(shí)組織中MDA含量的積累。

圖6 植酸和膠紅酵母結(jié)合對(duì)桃果MDA含量的影響Fig.6 Effect of R.mucilaginosa and PA on MDA concent of peach

3 結(jié)論

植酸由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而具有螯合能力，這種對(duì)多價(jià)陽離子的強(qiáng)螯合性能，有可能抑制某些酶的活性，從而對(duì)病原菌的生長起到抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度植酸對(duì)實(shí)驗(yàn)菌均有抑制作用，低濃度時(shí)抑菌程度不一，0.15%植酸對(duì)桃果采后根霉病的抑制效果最佳。植酸作為食品保鮮劑，能有效地提高食品貯存功能和改善食品質(zhì)量，使其色、香、味保持較長時(shí)間而營養(yǎng)不變[12]。本實(shí)驗(yàn)中，膠紅酵母與0.15%植酸結(jié)合處理顯著降低桃果貯藏時(shí)的褐變度。

本研究表明，0.15%植酸單獨(dú)處理對(duì)桃果采后根霉病的拮抗效力與對(duì)照相比，有顯著提高；且膠紅酵母和0.15%植酸結(jié)合處理，對(duì)桃果采后根霉病的拮抗效力與單獨(dú)使用膠紅酵母相比，有顯著提高。膠紅酵母與0.15%植酸結(jié)合處理對(duì)桃果自然狀況下病害的發(fā)生有顯著的抑制作用，并且對(duì)果實(shí)貯藏品質(zhì)沒有產(chǎn)生不利影響。植酸與膠紅酵母結(jié)合通過激發(fā)果實(shí)對(duì)病原菌的抗性，誘導(dǎo)果實(shí)抗性相關(guān)的酶活性，通過誘導(dǎo)了POD、PPO活性的增加，降低了MDA含量來減緩果實(shí)貯藏過程中的衰老和病原菌侵入。考慮到植酸是從植物中或植物加工后剩余物中提取的，應(yīng)用植酸不存在對(duì)人體健康和環(huán)境的安全性問題，所以植酸作為天然提取物增強(qiáng)酵母拮抗活性的方法是一種有效而且安全的新方法。

[1]Sholberg P L，Conway W S.Postharvest Pathology[M].In Agriculture Handbook Number 66：The Commercial Storage of Fruits，Vegetables，and Florist and Nursery Stocks.Edited by：Gross K C，Wang C Y，and Saltveit M.Published on line（http：//usna. usda.gov/hb66/contents.html）by the U.S.Department of Agriculture（USDA），the Agricultural Research Service（ARS），Washington D.C，USA，2004.

[2]EI Ghaouth A，Wilson C L，Wisniewski M，et al.Biological control of postharvest diseases of citrus fruits[M].Biological Control of Crop Diseases（Edited by Gnanamanickam，S S）.Marcel Dekker，Inc.New York，USA，2002：289-312.

[3]Li R P，Zhang H Y，Liu W M，et al.Biocontrol of postharvest gray and blue mold decay of apples with Rhodotorula mucilaginosa and possible mechanisms of action[J].International Journal of Food Microbiology，2011.

[4]Larrigaudière C，Torres R，Usall J.Storage performance of clementines treated with hot water，sodium carbonate and sodium bicarbonate dips[J].Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2002，77（3）：314-319.

[5]郝建軍，康宗利，于洋.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[6]周德慶，韓雅珊.紫外分光光度法快速測(cè)定果蔬及飲料中維生素含量的研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，2（5）：7-13.

[7]Lee C Y，Kagan V，Jaworski A W，et al.Enzymic browning in relation to phenolic compounds and polyphenoloxidase activity among various peach cultivars[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，38（1）：99-101.

[8]Aquino-Bola?os E N，Mercado-Silva E.Effects of polyphenol oxidase and peroxidase activity，phenolics and lignin content on the browning of cut jicama[J].Postharvest Biology and Technology，2004，33（3）：275-283.

[9]Lurie S，F(xiàn)allik E，Handros A，et al.The possible involvement of peroxidase in resistance to Botrytis cinereain heat treated tomato fruit[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1997，50（3）：141-149.

[10]Du D，Bramlage W J.Modified thiobarbituric acid assay for measuring lipid oxidation in sugar-rich plant tissue extracts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40：1566-1570.

[11]Mayer A M，Harel E.Polyphenol oxidases in plants[J]. Phytochemistry，1979，18（2）：193-215.

[12]Mohammadi M，Kazemi H.Changes in peroxidase and polyphenol oxidase activities in susceptible and resistant wheat heads inoculated with Fusarium graminearum and induced resistance[J].Plant Science，2002，162（4）：491-498.

[13]Jung W J，Jin Y L，Kim Y C，et al.Inoculation of Paenibacillus illinoisensis alleviates root mortality，activates of lignification-related enzymes，and induction of the isozymes in pepper plants infected by Phytophthora capsici[J].Biological Control，2004，30（3）：645-652.

[14]李好管.植酸的生產(chǎn)及應(yīng)用開發(fā)[J].上海化工，2001，20：33-36.

Control of postharvest Rhizopus decay of peaches by phytic acid in combination with Rhodotorula mucilaginosa

YANG Qi-ya，ZHANG Hong-yin*，PANG Shui-xiu，JIN Sha-sha
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

In order to search for an alternative to synthetic fungicides for the control of postharvest decay of peach fruits，the potential of using phytic acid in combination with Rhodotorula mucilaginosa for the control of postharvest Rhizopus decay of peaches was investigated.The results showed that the combined treatment of 0.15%PA with R.mucilaginosa significantly decreased Rhizopus decay incidence of peaches，remarkably controled the natural development of decay of peaches and did not impair postharvest quality parameters of these fruits under normal shelf-life condition.The combined treatment increased the activity of POD，PPO and reduced the content of MDA of peaches.

phytic acid；Rhodotorula mucilaginosa；peaches；Rhizopus decay；control

TS205

A

1002-0306（2012）05-0352-04

2011－05－16 *通訊聯(lián)系人

楊其亞（1983-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)。

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2009214）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。