黨法斌，高 峰，郭 磊，韓曉弟

（山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院，山東威海264209）

茶多酚含量測(cè)定方法研究綜述

黨法斌，高 峰，郭 磊，韓曉弟*

（山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院，山東威海264209）

近年來，茶多酚因其獨(dú)特的藥理性質(zhì)受到越來越廣泛的重視，然而茶多酚因其成分復(fù)雜，準(zhǔn)確測(cè)定困難，嚴(yán)重制約著對(duì)茶多酚功能的進(jìn)一步研究。綜述了近年來國內(nèi)外對(duì)茶多酚含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展，詳細(xì)敘述了酒石酸亞鐵分光光度法、原子吸收法、近紅外光譜法、高效液相色譜法等研究方法，以期對(duì)今后相關(guān)研究提供參考。

茶多酚，含量，測(cè)定方法

茶屬雙子葉植物，約30屬，500種，主要分布在亞洲和非洲，其次在美洲、大洋洲和歐洲也有分布，是世界上消費(fèi)最廣的飲料。經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)茶葉中含有機(jī)化學(xué)成分達(dá)四百五十多種，無機(jī)礦物元素達(dá)四十多種。其中有機(jī)化學(xué)成分和無機(jī)礦物元素含有許多營(yíng)養(yǎng)成分和藥效成分。越來越多的證據(jù)表明，從茶葉中提取的茶多酚在增強(qiáng)人體健康方面具有重要的作用。近年來，茶多酚因其獨(dú)特的藥理性質(zhì)受到越來越廣泛的重視[1]，許多體內(nèi)和體外研究都表明茶多酚可能在預(yù)防癌癥[2-4]、慢性胃炎[5-6]、神經(jīng)退化[7]和心血管疾病[8-9]中具有重要作用。對(duì)茶多酚與癌癥化學(xué)防御的分子機(jī)制的研究表明：調(diào)控細(xì)胞增殖的細(xì)胞外信號(hào)被茶多酚通過控制EFG受體的下調(diào)而抑制[10-11]。茶多酚是茶葉中酚類及其衍生物的總稱，主要包括兒茶素類、黃酮及黃酮醇類、花色素類、酚酸及縮酚酸類等四大類物質(zhì)。茶多酚是一系列化合物的混合物，目前經(jīng)分離鑒定的化合物就達(dá)400多種，而不同地區(qū)茶葉樣品中這些化合物的含量和種類亦各不相同，因此在測(cè)定某種茶葉中茶多酚含量時(shí)往往需要找到一種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品，若以每種純組分為對(duì)照來分別測(cè)定各種組分的含量，會(huì)使工作量大大增加且不切實(shí)際。因此，建立一種簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確的測(cè)定茶多酚相對(duì)含量的方法對(duì)促進(jìn)茶多酚的研究具有重要的實(shí)際意義。本文綜述了近年來國內(nèi)外茶多酚含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展，以期對(duì)相關(guān)研究提供參考。

1 茶多酚含量測(cè)定方法

1.1 酒石酸亞鐵分光光度法

茶多酚主要成分為兒茶素類和沒食子兒茶素類（母體結(jié)構(gòu)見圖1[12]），而沒食子酸丙酯（結(jié)構(gòu)見圖2）與兒茶素類在結(jié)構(gòu)上具有相同的特點(diǎn)，既具有鄰位酚性羥基和連位酚性羥基，又具有羥丙酯基。酒石酸亞鐵主要是與茶多酚中的鄰位羥基和連位羥基功能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)特定的顏色反應(yīng)，而對(duì)間位羥基和單羥基不顯色。

根據(jù)該原理：茶多酚（mg/mL）=E×1.5。

式中：E—根據(jù)試樣測(cè)得的吸光度（A），從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的沒食子酸乙酯相應(yīng)含量，mg/mL；1.5—茶多酚含量的換算系數(shù)，即1mg沒食子酸丙酯的吸光值相當(dāng)于1.5mg茶多酚吸光值。

王麗珠[13]等采用沒食子酸丙酯作為基準(zhǔn)物，酒石酸亞鐵作為顯色劑，利用分光光度法在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定茶多酚含量，其研究結(jié)果表明：當(dāng)溶液pH在7.5時(shí)，茶多酚與酒石酸亞鐵能形成穩(wěn)定的藍(lán)紫色或紅紫色絡(luò)合物，并且酒石酸亞鐵的加入量為4.0～6.0mL時(shí)，吸光值最大且穩(wěn)定。

目前國標(biāo)GB/T 21733－2008中也采用酒石酸亞鐵比色法對(duì)茶多酚含量進(jìn)行測(cè)定，但杜淑霞[14]等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該方法對(duì)奶茶類飲料樣品的預(yù)處理存在一定的缺陷，按標(biāo)準(zhǔn)方法處理樣品，得到的樣液渾濁，從而影響了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，不適合渾濁且成分復(fù)雜的奶茶樣品中茶多酚含量的測(cè)定，通過改進(jìn)樣品的處理方法，可以克服上述缺陷。

其研究表明：加入適量的鹽酸后，能夠促進(jìn)丙酮破乳和沉淀蛋白質(zhì)，從而可以提高奶茶飲料中茶多酚含量測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度，但因?yàn)椴瓒喾釉趐H4～8之間穩(wěn)定，因此加入鹽酸量過多，會(huì)降低茶多酚的測(cè)定結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在樣品澄清過程中加入0.50mL 1%鹽酸較合適。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)：樣品處理靜置時(shí)間在30min后，茶多酚含量趨于穩(wěn)定；比色測(cè)定放置時(shí)間在60min內(nèi)，絡(luò)合物較為穩(wěn)定，而在60min以后，吸光度開始下降。

此外，因?yàn)樵诓瓒喾幽阁w結(jié)構(gòu)中有一個(gè)苯環(huán)的鄰位含有2個(gè)羥基，因此具有還原性，可將Fe3+還原為Fe2+，而Fe2+可與鄰二氮菲發(fā)生反應(yīng)生成橘紅色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在509nm處具有最大吸光值，從而可通過測(cè)定該絡(luò)合物的吸光度來間接測(cè)定樣品中的茶多酚含量。

圖1 茶多酚的母體結(jié)構(gòu)Fig.1 Tea polyphenols maternal structure

圖2 沒食子酸丙酯Fig.2 Propyl gallate

1.2 原子吸收法

在中性介質(zhì)中，茶多酚也能與Pb2+發(fā)生沉淀反應(yīng)生成難溶的黃色沉淀[15]，因此可在茶葉樣品液中加入過量的Pb2+，通過原子吸收法測(cè)定上清液中Pb2+的濃度，從而得到一種間接測(cè)定茶多酚的方法。根據(jù)上述原理，雷存喜等[16]分別用分光光度法和間接原子吸收光譜法測(cè)定了黑茶樣品中茶多酚的含量。其研究結(jié)果表明：兩種測(cè)定方法之間具有良好的相關(guān)性，且具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于茶葉中茶多酚含量測(cè)定。

廖曉玲等[17]用堿式乙酸鉛作絡(luò)合沉淀劑，通過原子吸收法測(cè)定上清液中Pb2+的濃度，其研究發(fā)現(xiàn)測(cè)定時(shí)儀器最佳條件為：波長(zhǎng)217nm，通帶寬度0.4nm，燈電流為3.0mA，燃燒器高度為5.0nm。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)：當(dāng)反應(yīng)溫度在90℃以上，反應(yīng)時(shí)間為20min，溶液pH在5～8范圍內(nèi)，加入堿式乙酸鉛濃度為1mg/mL且加入量為1mL時(shí)，吸光值較為穩(wěn)定。研究結(jié)果表明：茶多酚濃度在3～25μg/mL范圍內(nèi)時(shí)完全符合Beer定律，具有靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，可方便地用于食品添加劑中微量茶多酚含量的測(cè)定。

1.3 近紅外光譜法

近紅外光譜技術(shù)是一種弱光譜分析技術(shù)，經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，現(xiàn)代近紅外光譜分析無論在理論上、技術(shù)上和應(yīng)用上都取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，目前已趨向成熟。與傳統(tǒng)的分析方法相比，近紅外光譜技術(shù)分析樣品具有方便、快速、高效、準(zhǔn)確和成本較低、不破壞樣品、不消耗化學(xué)試劑、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，目前在作品物質(zhì)分析、面粉加工業(yè)、煙草與紡織行業(yè)、食品分析、石油化工業(yè)分析、制藥行業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、過程分析等領(lǐng)域中取得了廣泛的應(yīng)用[18]。

其主要原理是：近紅外光譜區(qū)（780～2526nm）[19]與有機(jī)分子中含氫基團(tuán)（OH、NH、CH）振動(dòng)的合頻和各級(jí)倍頻的吸收區(qū)一致，通過掃描樣品的近紅外光譜，可以得到樣品中有機(jī)分子含氫基團(tuán)的特征信息，NIR光譜主要是反映C－H、O－H、N－H、S－H等化學(xué)鍵的信息，幾乎可覆蓋所有的有機(jī)化合物和混合物。

Quansheng Chen等[20]比較了利用不同的算法（PLS、iPLS和siPLS）建立數(shù)學(xué)模型來測(cè)定綠茶中總多酚的含量，其研究結(jié)果表明，與另外兩種算法相比，用siPLS算法建立數(shù)學(xué)模型可以更好地測(cè)定綠茶中總多酚的含量。

SiPLS（synergy interval partial least squares）是Norgaard等提出的[21]，建立在IPLS基礎(chǔ)上的一種波長(zhǎng)選擇算法，是IPLS的一個(gè)擴(kuò)展。通過不同波長(zhǎng)區(qū)間個(gè)數(shù)的任意組合，得到相關(guān)系數(shù)最大且誤差最小的波長(zhǎng)區(qū)間組合。其原理與IPLS相同，首先將NIR全譜分割成等長(zhǎng)的n個(gè)波長(zhǎng)區(qū)間，在每個(gè)子區(qū)間上進(jìn)行PLS回歸，建立待測(cè)組分的局部回歸模型，得到n個(gè)局部回歸模型。以交互驗(yàn)證均方根（RMSECV）和預(yù)測(cè)均方根（RMSEP）為各模型的精度衡量指標(biāo)，通過比較全光譜模型和各局部模型的精度，取精度最高的局部模型所在的子區(qū)間為建模波長(zhǎng)區(qū)間，然后再以該波長(zhǎng)區(qū)間為中心單向或雙向擴(kuò)充（或消減）波長(zhǎng)變量，得到最佳的波長(zhǎng)區(qū)間。

Quansheng Chen等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將光譜區(qū)分成23個(gè)區(qū)間和5個(gè)PLS組分時(shí)（表1），得到了用siPLS算法建立的最優(yōu)數(shù)學(xué)模型，并由此得出測(cè)量綠茶中總多酚含量的最佳波長(zhǎng)區(qū)間為7791.01～7960.71、7964.57～8134.27、8658.82～8828.52cm－1。

王毅等[22]利用小波消噪預(yù)處理茶葉近紅外光譜，濾去其中的噪聲信息，再用區(qū)間偏最小二乘法（iPLS）與遺傳算法（GA）相結(jié)合的PLS波長(zhǎng)篩選法iPLS－GA建立茶多酚的預(yù)測(cè)模型，即通過iPLS定位出若干信息區(qū)間，再用GA通過全局優(yōu)化，從中選出波長(zhǎng)點(diǎn)，最終共有18個(gè)波數(shù)點(diǎn)用于建立茶多酚模型，建模數(shù)據(jù)量大為減少。

其研究表明：經(jīng)小波消噪和iPLS-GA處理所得茶葉近紅外光譜模型最佳，模型在6158～6000cm-1和4717～4559cm-1區(qū)間中建立，校正時(shí)其相關(guān)系數(shù)Rc和交互驗(yàn)證均方根誤差RMSECV分別為0.9648和2.14，預(yù)測(cè)時(shí)的相關(guān)系數(shù)Rp和預(yù)測(cè)均方根誤差RMSEP分別為0.9587和2.22，均比其它模型好。

表1 siPLS校正模型選擇不同的光譜區(qū)間時(shí)的結(jié)果Table 1 Results of siPLS calibration model selected different spectral regions

1.4 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。20世紀(jì)60年代后期，已經(jīng)發(fā)展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術(shù)開始應(yīng)用于液相色譜，使液相色譜得到了迅速的發(fā)展。目前，高效液相色譜法因其高效、高靈敏度、分析速度快的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。

1974年，美國AC Hoefler等[23]提出用HPLC法測(cè)定茶葉中多酚物質(zhì)，配合使用反向鍵合填充劑，可將茶葉提取液直接注入色譜柱，30min之內(nèi)就達(dá)到了理想的分離，配以紫外檢測(cè)器就能迅速、準(zhǔn)確地測(cè)定出多酚物質(zhì)的含量。

張小紅等[24]采用HPLC法，以Alltima phenyl柱（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱，以甲醇∶水∶磷酸（21∶78.9∶0.1）為流動(dòng)相，流速1.0mL·min-1，在波長(zhǎng)278nm處測(cè)定綠茶雪哈片中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量。研究表明：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）在0.6048～3.024μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。此外，該實(shí)驗(yàn)中通過比較不同的色譜柱和流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)采用Alltima苯基柱和等度洗脫的方法可以達(dá)到快速分離EGCG的目的，并且因?yàn)镋GCG中含大量的酚羥基，所以在流動(dòng)相中加入少量的酸可以抑制酚羥基與硅醇基結(jié)合，以防止在洗脫時(shí)產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。

劉錦文等[25]以DiamonsilC18（4.6mm×200mm，5μm）為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液（68∶32）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量20μL，柱溫25℃，流速10mL·min-1的條件下，發(fā)現(xiàn)茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）在20min內(nèi)出現(xiàn)峰值，并且以279nm為吸收波長(zhǎng)，EGCG進(jìn)樣量在0.1～0.6μg，ECG進(jìn)樣量在0.05～1.2μg范圍內(nèi)時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)語

20世紀(jì)80年代以來，茶多酚因其抗氧化作用和良好的藥理作用，高效的抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、降血糖和血脂、治心血管病、抑菌抑酶等作用，在食品工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和日用化工中得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)GB/T8313－2008和GB/T8313-2002所測(cè)數(shù)據(jù)之間存在很大的差異[26]，雖然目前國內(nèi)外對(duì)茶多酚含量測(cè)定方法的研究已有很多，但茶多酚因其成分復(fù)雜，不同的測(cè)定方法之間存在較大差異且多穩(wěn)定性、重復(fù)性較差，因此準(zhǔn)確測(cè)定困難，嚴(yán)重制約著對(duì)茶多酚功能、機(jī)制的進(jìn)一步研究。因此，發(fā)現(xiàn)一種高效、準(zhǔn)確、綠色、穩(wěn)定的含量測(cè)定方法對(duì)茶多酚的深入研究具有重要意義。

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Research status of determination method of tea polyphenol content

DANG Fa-bin，GAO Feng，GUO Lei，HAN Xiao-di*
（Marine College，Shandong University at Weihai，Weihai 264209，China）

In recent years，tea polyphenol because of its unique pharmacological nature are getting more and more extensive attention，however，the complex of composition and difficulty of accurately determination constrain the further study of tea polyphenols’function.The content determination method research progress of tea polyphenols of domestic and foreign in recent years was reviewed，the ferrous tartaric acid spectrophotometric method，atomic absorption method，the near infrared spectra method and HPLC method were narrated，so as to provide a reference for future studies.

tea polyphenols；content；determination method

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0410-04

2011－03－31 *通訊聯(lián)系人

黨法斌（1989-），男，在讀本科生，研究方向：生物技術(shù)。

山東大學(xué)威海分?？蒲辛㈨?xiàng)資助項(xiàng)目（SRTPA10038）。