李昌寶，游向榮，孫 健，李 麗，張娥珍，王振興，邱文武，王文林

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧530007；3.廣西亞熱帶作物研究所試驗站，廣西龍州532415）

超聲強化提取山黃皮果總黃酮及其抗氧化活性的研究

李昌寶1，2，游向榮1，*，孫 健1，李 麗1，張娥珍1，王振興1，邱文武3，王文林3

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧530007；3.廣西亞熱帶作物研究所試驗站，廣西龍州532415）

采用超聲強化提取山黃皮果中的總黃酮，通過正交實驗方法確定山黃皮果總黃酮優(yōu)化的提取工藝，并測定其對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和羥自由基（·OH）的清除效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本實驗條件下，超聲強化提取山黃皮果總黃酮的優(yōu)化提取工藝條件為提取溫度70℃、液料比40∶1（v/m）、乙醇濃度60%（v/v）、提取時間60min；在優(yōu)化條件下，山黃皮果總黃酮得率為3.82%±0.02%；山黃皮果總黃酮對DPPH·和·OH均有較強的清除能力。研究可為山黃皮果開發(fā)利用提供參考。

山黃皮果，總黃酮，超聲波提取，抗氧化活性

山黃皮（Clausena indica（Datz）.Oliv.）俗稱雞皮 果，主產(chǎn)于我國廣西西南部、云南南部、廣東新會及越南北部和菲律賓[1]。山黃皮營養(yǎng)價值高，果實總酸度為2.28%，含總糖9.8%，蛋白質(zhì)1.39%，維生素C 74mg/100g，總固形物17.5%，氨基酸總量1710mg/100g，此外還含有豐富的鐵、鈣等各種營養(yǎng)元素[2]。廣西山黃皮資源豐富，產(chǎn)品出口東南亞及港澳地區(qū)，成為著名的龍州三寶（枧木砧板、山黃皮、桄榔粉）之一，是一種具有開發(fā)應(yīng)用前景的資源。黃酮類化合物由于具有活潑的羥基氫而具有抗氧化性，是許多中草藥的主要有效成分之一。此類化合物能夠抑制脂質(zhì)過氧化作用（LPO）、血小板凝聚、毛細管滲透性、脆性，以及降低環(huán)氧合酶和脂肪氧合酶等的活性[3-4]。其在醫(yī)藥領(lǐng)域，在延緩衰老、防治心腦血管疾病等方面具有積極作用。常見的黃酮類物質(zhì)提取方法有堿性水提取法、醇提取法和其它有機溶劑提取法等，但這些方法存在提取溫度高、用時長等缺點，使黃酮類物質(zhì)因為離子化、氧化和水解而損失[5]。超聲強化提取是一種操作簡單，效率較高的技術(shù)，采用超聲波強化從植物中提取活性物質(zhì)可減少溶劑用量和提取的時間，降低提取溫度，有利于提取熱敏感物質(zhì)和不穩(wěn)定的物質(zhì)[6-7]。近年來，山黃皮果、葉中總黃酮的提取已有報道[8-9]，但對其抗氧化活性未見涉及。本實驗采用超聲強化提取山黃皮果中黃酮類化合物，以總黃酮得率為考察指標，通過單因素實驗和正交實驗的方法對提取工藝條件進行研究，確定其優(yōu)化提取工藝，并對山黃皮果總黃酮的抗氧化性進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山黃皮果 采摘于廣西龍州廣西亞熱帶作物研究所實驗站，挑選顏色（黃色）、成熟度（9成熟）一致，無病蟲害的果實作為原料，果實可溶性固形物含量17%±0.2%；蘆?。ㄉ噭兌取?8%）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇 均為分析純。

BILON-2008低溫超聲波萃取儀 上海比朗儀器有限公司；FW 800型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-3200 PCS型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；101-2型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；AR124CN型電子天平 奧豪斯儀器有限公司；DKS-12型不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋 杭州藍天化驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 山黃皮果→去核→60℃干燥至水分含量3.37%±0.2%→粉碎→過60目篩→按一定液料比加入乙醇溶劑→超聲波處理→過濾→定容→測定吸光值

1.2.2 回歸方程的建立 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，稱取蘆丁標準品0.1g，用30%乙醇溶解并定容至500mL，分別取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5mL蘆丁待測液于10mL刻度具塞試管中，加入5%亞硝酸鈉0.3mL后放置6min，加入10%硝酸鋁0.3mL，再放置6min，加入4%氫氧化鈉4mL，最后用30%乙醇溶液補充到10mL，靜置15min，510nm處測吸光度，并建立回歸方程：C=0.1375×A-0.0007，R2=0.9997。

1.2.3 總黃酮含量測定 稱取1g山黃皮果粉末，用95%乙醇溶解浸提24h后，經(jīng)超聲波輔助提取，過濾并濃縮后，用30%乙醇定容至50mL，吸取2mL于10mL具塞試管中，然后按照1.2.2測定吸光值。通過回歸方程計算得到總黃酮含量。

1.2.4 超聲提取工藝條件 準確稱取一定量的山黃皮果干粉，在不同乙醇濃度、提取溫度、液料比和提取時間條件下在超聲波儀中進行提取。將提取液過濾、定容，測定吸光度，計算總黃酮含量。以每g干粉所提取的總黃酮（以蘆丁計）的g數(shù)表示總黃酮得率。在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取提取時間、溫度、液料比、乙醇濃度4個因素，每個因素3個水平，總黃酮得率為考察指標，進行L9（34）正交實驗，優(yōu)化總黃酮提取的工藝條件。各因素與水平設(shè)計見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 DPPH自由基清除率的測定 參考Larrauri和Yokozawa等[10-11]的測定方法，在此基礎(chǔ)上進行了修改，分別取2mL濃度為25、50、100、200、300μg/mL的待測液體于具塞試管中，加入2×10-4mol/L的DPPH溶液2mL，搖勻，30min后，在515nm處測定其吸光度值A(chǔ)i；同時測定2mL DPPH溶液與2mL 70%乙醇混合后的吸光度值A(chǔ)c和2mL待測液與2mL 70%乙醇混合后的吸光度值A(chǔ)j，均以70%乙醇作參比。根據(jù)下式計算清除率：

式中Ac：DPPH與溶劑混合液的吸光值；Ai：DPPH與樣液反應(yīng)后的吸光值；Aj：樣液與溶劑混合液的吸光值。以抗壞血酸（VC）作陽性對照。

(1)加強對品管圈護理人員與患者的教育與知識宣傳,向患者講解內(nèi)瘺穿刺的原理方法以及在穿刺時對患者的要求,并鼓勵家屬共同參與,提高護理人員及患者對內(nèi)瘺穿刺點滲血的認識,以達到減少并盡量避免動靜脈內(nèi)瘺穿刺點滲血的效果。

1.2.6 羥自由基（·OH）清除率的測定 本實驗在Smironff[12]等報道的方法的基礎(chǔ)上進行了改進，在具塞試管中依次加入9mmol/L FeSO4溶液2mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL、濃度為25、50、100、200、300μg/mL的樣液2mL和8.8mmol/L H2O22mL，搖勻，于37℃水浴中反應(yīng)30min，在510nm下測定吸光度值A(chǔ)X。并按相同方法，測定不加樣液的溶液的吸光度A0，不加H2O2溶液的吸光度AX0，均以蒸餾水為參比。清除率計算公式如下：

式中：A0：空白對照液的吸光度；AX：加入樣液后的吸光度；AX0：不加H2O2樣液的吸光度。以抗壞血酸（VC）作陽性對照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 運用SAS軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對山黃皮果總黃酮得率的影響 在液料比40∶1（v/m）、溫度50℃、時間60min條件下，分別選取不同體積分數(shù)的乙醇溶液對材料進行超聲提取，然后測定總黃酮含量，結(jié)果如圖1所示。

單因素方差分析得，F(xiàn)=330.05，plt;0.01，表明乙醇濃度對山黃皮果總黃酮得率影響極顯著。從圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)乙醇濃度為60%時，總黃酮得率達到最大值，之后隨著乙醇濃度的增加，黃酮類化合物得率呈下降趨勢。原因可能是乙醇濃度增高后，使一些醇溶性雜質(zhì)和親脂性色素等成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的提取量下降[13-14]。

圖1 乙醇濃度對山黃皮果總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv

圖2 超聲處理時間對山黃皮果總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv

2.1.2 超聲處理時間對山黃皮果總黃酮得率的影響 在溫度50℃、乙醇濃度60%、液料比40∶1（v/m）條件下，分別超聲強化處理15、30、45、60、75min，然后測定其總黃酮得率，結(jié)果如圖2所示。單因素方差分析得F=29.56，plt;0.01，表明超聲強化處理時間對山黃皮果總黃酮得率影響極顯著。從圖2可以看出，總黃酮得率隨處理時間的延長而逐漸升高，但45min后總黃酮得率變化不大。這是因為用超聲提取45min，總黃酮的浸出已經(jīng)很充分；而當(dāng)時間超過45min后，隨著提取時間的延長，得率反而越低，這可能是由于超聲的作用時間太長而破壞其中的有效成分。

圖3 液料比對山黃皮果總黃酮的影響Fig.3 Effect of different liquid to solid ratio on the extraction rate of flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv

單因素方差分析得F=33.34，plt;0.01，表明液料比對山黃皮果總黃酮得率影響極顯著。由圖3可知，隨著液料比的增加總黃酮得率逐漸增加，當(dāng)液料比達到40∶1后得率變化不大，由于液料比越大，溶劑的用量就會增加，導(dǎo)致提取成本增高，而且增加除去溶劑的難度，因此選取液料比40∶1為最佳液料比。

2.1.4 提取溫度對山黃皮果總黃酮得率的影響 在乙醇體積分數(shù)60%、超聲處理時間45min、液料比40∶1，不同溫度條件下進行提取，然后測定總黃酮含量，結(jié)果如圖4所示。

單因素方差分析得F=5.83，plt;0.05，表明提取溫度對山黃皮果總黃酮得率影響顯著。由圖4可知，隨著提取溫度的升高總黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)提取溫度達到60℃后得率變化不大。從節(jié)約能耗和黃酮得率等角度考慮，選取60℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對山黃皮果總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv

2.2 正交實驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交表進行實驗方案設(shè)計，其因素水平設(shè)置見表1，實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交設(shè)計方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variances of orthogonal design

由表2可以看出，影響山黃皮果總黃酮得率的因素主次順序為：提取溫度（B）＞液料比（C）＞時間（A）＞乙醇濃度（D）。

由表2可知，超聲波提取山黃皮果總黃酮的最佳組合為A3B3C2D2，即提取時間60min、提取溫度70℃、液料比40∶1、乙醇體積分數(shù)60%。對最佳工藝條件A3B3C2D2進行3次平行實驗，結(jié)果山黃皮總黃酮的得率為3.82%± 0.02%，比梁云貞[9]報道的微波方法提取山黃皮果黃酮類化合物得率3.621%高，可見，超聲強化提取山黃皮果中的黃酮類物質(zhì)效果優(yōu)于微波提取法。

由表3方差分析看出，在超聲波提取山黃皮果總黃酮正交實驗中所選擇的因素和水平范圍內(nèi)，提取溫度和液料比都達到顯著水平（Plt;0.05），而其它各因素影響不顯著。

2.3 山黃皮果總黃酮抗氧化活性實驗結(jié)果

2.3.1 山黃皮黃酮對DPPH自由基清除作用 以抗壞血酸（VC）作對照，測定了山黃皮果總黃酮清除DPPH自由基的能力，結(jié)果見圖5。

圖5 山黃皮果總黃酮對DPPH·的清除效果Fig.5 Scavenging effect of flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv on DPPH·

統(tǒng)計分析，T=6.94，p=0.0023lt;0.01，山黃皮和VC清除DPPH·效果差異顯著。由圖5可知，山黃皮果總黃酮和VC對DPPH·的清除能力隨著濃度的增大而增強，當(dāng)濃度大于100μg/mL時，兩者的提高速率變緩，山黃皮果總黃酮的清除率高于VC，說明山黃皮果的黃酮提取物對DPPH·具有較強的清除作用。

2.3.2 山黃皮果總黃酮對OH自由基清除作用 以抗壞血酸（VC）作對照，測定山黃皮果黃酮清除羥自由基的能力，結(jié)果見圖6。

圖6 山黃皮果總黃酮對·OH的清除效果Fig.6 Scavenging effect of flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv on·OH

統(tǒng)計分析，T=5.05，p=0.0073lt;0.01，山黃皮果和VC清除·OH效果差異顯著。由圖6可知，山黃皮果總黃酮提取物及抗壞血酸（VC）兩者對·OH的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增大。在25～300μg/mL濃度范圍內(nèi)，山黃皮果總黃酮提取物對·OH的清除能力比抗壞血酸（VC）強。

3 結(jié)論

采用超聲波強化處理技術(shù)提取山黃皮果的總黃酮，通過單因素實驗和正交實驗得出最佳工藝條件為超聲提取時間60min、提取溫度70℃、液料比（v/m）40∶1、乙醇體積分數(shù)60%；在此工藝條件下，山黃皮果的總黃酮得率為3.82%±0.02%。山黃皮果的總黃酮對羥自由基（·OH）和1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）均有較好的清除效果，是一種有效的外源性抗氧化劑，其清除機理有待進一步研究。

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Study on ultrasonic extraction of flavonoids from Clausena indica（Datz）.Oliv.and its antioxidative activity

LI Chang-bao1，2，YOU Xiang-rong1，*，SUN Jian1，LI Li1，ZHANG E-zhen1，WANG Zhen-xing1，QIU Wen-wu3，WANG Wen-lin3
（1.Institute of Agro-food Scienceamp;Technology，Guangxi Academy of Agricultrual Sciences，Nanning 530007，China；2.Guangxi Crop Genetic Improvement Laboratory，Nanning 530007，China；3.Guangxi Subtropical Crops Research Institute Experimental Station，Longzhou 532415，China）

The optimum conditions for extracting flavonoids in Clausena indica（Datz）.Oliv by ultrasonic were determined by using the orthogonal experimental design.Meanwhile，the flavonoids'effect on removal of·OH and DPPH·was investigated.The result showed that the optimal technological parameters were as follows：the extracting temperature was 70℃，the ratio of solvent and material was 40∶1（v/m），the concentration of solvent was 60%（v/v），and the extracting time was 60min.Under the optimum conditions，the total extracting rate was as high as 3.82%±0.02%.The flavonoids from Clausena indica（Datz）.Oliv showed good effect on removal of ·OH and DPPH·.This study provided application and development of Clausena indica（Datz）.Oliv fruit.

Clausena indica（Datz）.Oliv fruit；total flavonoids；ultrasonic extraction；antioxidative activity

TS255.1

B

1002-0306（2012）05-0265-04

2011－05－26 *通訊聯(lián)系人

李昌寶（1981-），男，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金（2011JM21）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金（201006）。