王章存，陸 杰，2，李樂靜，崔勝文

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.江蘇省泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇泰州225300）

谷朊粉的有限酶解對(duì)其分散性及膠黏性的影響

王章存1，陸 杰1，2，李樂靜1，崔勝文1

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.江蘇省泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇泰州225300）

為了改善谷朊粉在水溶液中的物化性能，利用堿性蛋白酶對(duì)谷朊粉進(jìn)行了有限水解。通過單因素實(shí)驗(yàn)，分析了底物濃度、反應(yīng)溫度、加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)其分散穩(wěn)定性、膠黏性的影響，并分析了酶解物中的蛋白質(zhì)分子粒徑。通過正交實(shí)驗(yàn)確定了以提高谷朊粉分散特性和膠黏性為目的的最佳酶解條件為：底物濃度0.30g/mL、溫度50℃、加酶量0.50%、反應(yīng)時(shí)間20min，此時(shí)可使谷朊粉的相對(duì)分散穩(wěn)定性達(dá)到96.3%，黏度為3.2mPa·s，蛋白質(zhì)平均分子粒徑604.6nm。分析顯示，不同酶解樣品分散穩(wěn)定性、黏度和蛋白質(zhì)平均分子粒徑三種指標(biāo)之間的變化趨勢(shì)并不完全一致。

谷朊粉，有限酶解，分散穩(wěn)定性，膠黏性，蛋白質(zhì)粒徑

谷朊粉是小麥淀粉生產(chǎn)的一種副產(chǎn)品，主要由麥谷蛋白以及麥醇溶蛋白組成，具有優(yōu)良的黏彈性、薄膜成型性、吸脂乳化性等，對(duì)小麥面粉食品的加工品質(zhì)有重要的影響[1-3]。但是，谷朊粉中的蛋白質(zhì)都是大分子，且含有較多的疏水性氨基酸[4]，在水中的溶解性和分散性很差，無法與溶液中的其他成分形成均勻的體系，限制了它作為食品配料在食品工業(yè)尤其是流體食品加工中的應(yīng)用范圍。因此，谷朊粉的改性已成為小麥蛋白深加工研究的一個(gè)熱點(diǎn)，其中，酶法改性應(yīng)用最為廣泛，通過酶解作用將大分子的谷朊粉蛋白質(zhì)降解，提高其在水中的溶解性、乳化性和起泡性等功能性[5-7]。但是，目前文獻(xiàn)中對(duì)谷朊粉酶解物的溶解性、乳化性和起泡性等功能性質(zhì)的分析往往局限于酶解后離心處理得到的可溶性部分[8-11]。這些研究有諸多弊端，一是產(chǎn)物的得率（即酶解可溶性部分與原料的比率）低，影響在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用；二是可溶部分大多是小分子蛋白質(zhì)和小肽，影響其乳化性、起泡性、黏彈性等，因?yàn)榇蠓肿拥鞍踪|(zhì)才具有這樣的功能性質(zhì)。目前文獻(xiàn)對(duì)谷朊粉流變學(xué)的分析主要是谷朊粉加入少量水后在固體或半固體狀態(tài)下的結(jié)果，在水溶液中谷朊粉只在局部聚集形成面筋團(tuán)[12-15]。實(shí)際上，谷朊粉經(jīng)過有限酶解后只要在水中有較好的分散性即可大大拓展它的用途，如用于豆腐、火腿腸等凝膠型和蛋白飲料等液體型食品的開發(fā)，也可用于可降解性食品包裝材料蛋白膜中。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)谷朊粉的實(shí)際應(yīng)用特點(diǎn)，首次提出以酶解產(chǎn)物的分散特性為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)、兼顧其膠黏性、分子粒徑等指標(biāo)，研究堿性蛋白酶有限酶解對(duì)谷朊粉上述指標(biāo)的影響，以期既改善谷朊粉在食品加工中的功能性質(zhì)，又能大大提高谷朊粉酶解物的產(chǎn)品得率（注：本實(shí)驗(yàn)谷朊粉酶解后不離心直接用于性能分析，故產(chǎn)品得率為100%）。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉 蛋白質(zhì)含量80.6%（W/W），鄭州新威營(yíng)養(yǎng)科技有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L） 諾維信公司；氫氧化鈉（分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；鹽酸（分析純） 開封市芳晶化學(xué)試劑有限公司。

868型酸度計(jì) 上海熱電儀器有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器 江蘇金壇正基儀器有限公司；FA1004電子天平 上海上平儀器有限公司；TDA型電子恒溫水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠；NDJ-7型旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì) 上海安德儀器設(shè)備有限公司；UV-2100型紫外可見光分光光度計(jì) 上海尤尼科儀器有限公司；Zeta-Plus激光粒度儀 美國(guó)BrookHaven公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 谷朊粉酶解物的制備 在酶反應(yīng)器中，將蒸餾水加熱至設(shè)定的溫度，攪拌條件下，將谷朊粉加入其中，制成一定濃度的蛋白質(zhì)懸浮液，調(diào)節(jié)設(shè)定pH后，恒溫?cái)嚢瑁构入梅鄢浞秩苊?，將蛋白酶按一定比例加入懸浮液中（各單因素?shí)驗(yàn)時(shí)的具體酶解條件見結(jié)果與分析部分），開始計(jì)時(shí)，振蕩并保持恒溫，酶解過程中不斷用氫氧化鈉（1.0mol/L）滴定維持溶液pH恒定。水解結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH至中性，于沸水浴中加熱10min使酶失活，冷卻，即得谷朊粉酶解物。

1.2.2 酶解物分散性測(cè)定 取一定量的酶解物，稀釋至體積為100mL、濃度1.0mg/mL后，于分光光度計(jì)中280nm處測(cè)定其吸光值（A），記錄10min內(nèi)吸光值的變化。最大值（Amax）、最小值（Amin）的相對(duì)大小可以反映酶解物中蛋白質(zhì)分子沉降情況，即分散特性，二者的比值則反映酶解物的分散穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。酶解物初始吸光度值即為最大值，隨著蛋白分子沉降，吸光度值會(huì)有所降低，沉降越慢，吸光度值降低越少，分散越穩(wěn)定。所以，根據(jù)以上蛋白沉降與光吸收值關(guān)系可將酶解物分散穩(wěn)定性定義為：

1.2.3 酶解物黏度測(cè)定 將不同酶解條件下的樣品用水稀釋至體積為200mL濃度均為0.1g/mL后，采用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)定溶液的黏度（η），每組樣品重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。

1.2.4 酶解物蛋白質(zhì)分子粒徑測(cè)定[16]取一定量不同酶解條件下的酶解物樣品，稀釋至體積為100mL、濃度為0.50mg/mL后，于Zeta-Plus激光粒度儀中測(cè)定其粒徑大小分布和比例，以平均粒徑表示酶解物蛋白分子粒徑大小。平均粒徑=∑（粒徑大小×該粒徑所占比例）/∑粒徑所占比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷朊粉濃度對(duì)酶解物性質(zhì)的影響

分別配制不同底物濃度0.10～0.30g/mL的谷朊粉懸浮液500mL進(jìn)行酶解，酶解溫度50℃，加酶量E/S為0.50%，pH8.5，酶解時(shí)間10min。反應(yīng)結(jié)束后，分別取樣稀釋至規(guī)定濃度后，測(cè)定不同樣品的分散性和分散穩(wěn)定性、黏度及蛋白質(zhì)分子粒徑，結(jié)果如圖1所示。

圖1 底物濃度對(duì)酶解物性能和分子粒徑的影響Fig.1 Effect of gluten concentration on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

研究發(fā)現(xiàn)，在不同底物濃度下酶解產(chǎn)物的分散性差別不大，但隨著底物濃度的增加，谷朊粉酶解物的分散穩(wěn)定性及黏度都有所提高，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^0.25g/mL后，上述指標(biāo)增加幅度有所減緩，底物濃度達(dá)0.30g/mL時(shí)上述指標(biāo)增長(zhǎng)趨于平緩（圖1a）。這可能與谷朊粉酶解時(shí)蛋白質(zhì)分子的變化有關(guān)。谷朊粉經(jīng)過適當(dāng)酶解后，蛋白質(zhì)大分子變?yōu)橄鄬?duì)較小的分子，在水中的分散性增加，同時(shí)也表現(xiàn)出一定的黏性。低濃度酶解物的分散穩(wěn)定性較低，可能與其分子不均一性有關(guān)；而在較高底物濃度水解時(shí)，蛋白質(zhì)分子被降解的程度較低且分子大小較為均勻，蛋白質(zhì)分子之間更容易粘連，溶液膠黏性和分散穩(wěn)定性較高。用激光粒度儀測(cè)定結(jié)果也表明，高濃度酶解后蛋白質(zhì)分子的平均粒徑大于低濃度時(shí)的平均粒徑（圖1b），且低濃度酶解的產(chǎn)物中分子大小離散度較大。因此，確定最適的底物濃度為0.30g/mL。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解物性質(zhì)的影響

配制谷朊粉濃度0.30g/mL溶液500mL，酶解溫度50℃，加酶量為0.50%和pH8.5時(shí)，測(cè)定不同酶解時(shí)間（10、20、30、40、50min）后的酶解物的分散特性、黏度及蛋白質(zhì)分子粒徑。結(jié)果表明，隨著酶解時(shí)間的增加，谷朊粉酶解物的分散穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì)，而黏度呈下降趨勢(shì)（圖2a）。這可能是酶解時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白分子越小，在水中分散性較好，呈溶解狀態(tài)而不容易沉淀。但是，小蛋白分子之間不易膠粘，溶液黏度會(huì)大大下降。從粒徑分析的結(jié)果（圖2b）也可以看出，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶解物中蛋白分子的平均粒徑也不斷下降。雖然隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，分散性會(huì)略有提高，但相差并不是很大，而膠黏性卻下降很多，不利于谷朊粉酶解產(chǎn)物的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，確定最適的酶解時(shí)間為10min。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)酶解物性能和分子粒徑的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

2.3 加酶量對(duì)酶解物性質(zhì)的影響

配制500mL谷朊粉濃度為0.30g/mL溶液，在酶解溫度50℃，pH8.5和酶解時(shí)間10min條件下，考察不同加酶量水解對(duì)谷朊粉分散特性、黏度及其蛋白質(zhì)分子粒徑的影響，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯觯S著加酶量的提高，谷朊粉酶解物的分散穩(wěn)定性略有提高，而黏度卻不斷下降?？赡苁窃黾用赣昧渴沟玫鞍姿獾酶鼮槌浞郑鞍最w粒變小，粒徑分析的結(jié)果（圖3b）也證明了這一點(diǎn)。另外，增加酶用量還會(huì)干擾酶解液的組成且大大增加成本，而加酶量小于0.50%時(shí)谷朊粉蛋白質(zhì)分子幾乎無法在水中分散，也無法測(cè)定其黏度，因此，確定最適的加酶量為0.50%。

2.4 酶解溫度對(duì)酶解物性質(zhì)的影響

配制500mL谷朊粉濃度為0.30g/mL溶液，在加酶量為0.50%，pH8.5和酶解時(shí)間10min條件下，測(cè)定不同的酶解溫度下樣品的分散特性、黏度及蛋白質(zhì)分子粒徑。結(jié)果表明，溫度在40～50℃之間時(shí)，隨著溫度的升高，酶解物的分散穩(wěn)定性及黏度呈上升趨勢(shì)；溫度高于50℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶解物的分散穩(wěn)定性幾乎不變，而黏度呈下降趨勢(shì)（圖4）。這可能是溫度低于50℃時(shí)，酶的活性較低，蛋白不能充分酶解，無法在水中很好地分散形成穩(wěn)定懸浮液；溫度高于50℃時(shí)，隨著溫度的升高酶的活性有所提高，但蛋白質(zhì)分子只是略微變小，所以酶解物分散穩(wěn)定性幾乎不變，而黏度略微下降。粒徑分析結(jié)果與此分析也相吻合（圖4b）。此外，溫度高于60℃時(shí)，堿性酶會(huì)因溫度過高而逐漸失活，同時(shí)還會(huì)引起蛋白結(jié)團(tuán)，不易形成穩(wěn)定的分散懸浮液，也不利于酶解反應(yīng)。因此，確定最適的酶解溫度為50℃。

圖3 加酶量對(duì)酶解物性能和分子粒徑的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

圖4 酶解溫度對(duì)酶解物性能和分子粒徑的影響Fig.4 Effect of the temperature on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

2.5 堿性蛋白酶水解谷朊粉條件優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)可知，在堿性蛋白酶水解谷朊粉的反應(yīng)中，影響因素主要有時(shí)間、溫度、加酶量以及底物濃度，為了得到分散性能較好、黏度較高的酶解物，在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)對(duì)堿性蛋白酶水解谷朊粉的條件進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)液體積為500mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 1 Results of orthogonal test for enzymolysis of wheat gluten

由極差分析可以看出，4個(gè)因素對(duì)谷朊粉分散性影響的主次順序?yàn)椋篋gt;Bgt;Cgt;A，即底物濃度gt;反應(yīng)溫度gt;加酶量gt;反應(yīng)時(shí)間，最優(yōu)組合為A3B2C1D3，與正交表中的第8組實(shí)驗(yàn)一致，此最佳條件下谷朊粉分散性為98.5%，黏度為2.8mPa·s。4個(gè)因素對(duì)谷朊粉膠黏性影響的主次順序?yàn)椋篋gt;Cgt;Agt;B，最優(yōu)組合為A1B2C1D3，這個(gè)組合并未出現(xiàn)在正交表中，按此優(yōu)化條件安排實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為谷朊粉分散性為92.6%，黏度為3.4mPa·s?？梢钥闯觯瑑山M的最佳溫度（50℃）、加酶量（0.50%）及底物濃度（0.30g/mL）都相同，只是酶解時(shí)間有所區(qū)別。酶解時(shí)間較長(zhǎng)，酶解物分散性較好，但蛋白顆粒較小，黏度會(huì)大大下降，并不利于谷朊粉進(jìn)一步在生產(chǎn)中的應(yīng)用，縮短酶解時(shí)間可提高谷朊粉黏度，同時(shí)對(duì)其分散性影響并不大，仍能維持在90%以上。因此，綜合考慮對(duì)谷朊粉分散性及黏度的影響，確定最佳酶解條件為A2B2C1D3，即時(shí)間20min，溫度50℃，加酶量0.50%，底物濃度0.30g/mL。此時(shí)谷朊粉分散性為96.3%，粘度為3.2mPa·s，均達(dá)到較高水平，蛋白質(zhì)分子平均粒徑也達(dá)到了604.6nm，高于正交實(shí)驗(yàn)中各組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明分析所得的最佳酶解條件是可靠的。

為了進(jìn)一步考察不同酶解樣品的分散穩(wěn)定性、黏度和分子粒徑之間的關(guān)系，將其三種指標(biāo)的分析結(jié)果列于圖5。可以看出，樣品中蛋白質(zhì)平均分子粒徑和黏度并不是隨著分散穩(wěn)定性的增大而持續(xù)增加；平均分子粒徑與黏度的變化趨勢(shì)雖然相似，但在具有不同分散穩(wěn)定性樣品中，二者的變化幅度并不相同，說明酶解物的分散穩(wěn)定性和黏度需要不同的蛋白質(zhì)分子特征。

圖5 谷朊粉酶解物分散穩(wěn)定性、黏度和分子粒徑之間的相關(guān)性Fig.5 Relationship between disperse stationarity，viscosity and average size of the hydrolysates

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)首次研究了以改善谷朊粉的分散性能和膠黏性為目的的酶解條件，在單因素分析的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果為：底物濃度0.30g/mL，溫度50℃，加酶量0.50%，反應(yīng)時(shí)間20min，在此條件下得出的谷朊粉酶解物分散穩(wěn)定性為96.3%，黏度達(dá)到了3.2mPa·s，得到了較滿意的效果。

3.2 對(duì)谷朊粉酶解物粒徑分布及分散性能、膠黏性能關(guān)系的分析表明，蛋白質(zhì)平均分子粒徑和黏度并不是隨著分散穩(wěn)定性的增大而持續(xù)增加，三種指標(biāo)之間的變化程度并不完全一致。

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Effect of limited enzymatic hydrolysis on dispersity and viscosity of wheat gluten

WANG Zhang-cun1，LU Jie1，2，LI Le-jing1，CUI Sheng-wen1
（1.School of Food＆Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；2.Product Quality Supervising and Inspecting Institute of Taizhou City，Taizhou 225300，China）

Wheat gluten was limited hydrolyzed by Alcalase to improve its physical and chemical properties.The effects of hydrolysis conditions such as gluten concentration，reaction temperature，enzyme-gluten ratio and reaction time on the dispersity stationarity and viscosity of wheat gluten hydrolysates were researched first with the single factor experiment.The protein molecular partical size of the hydrolysates was also determined.And then，the optimized condition of the proteolysis was carried out by orthogonal experiment as the following：gluten concentration was 0.30g/mL，temperature was 50℃，enzyme-substrate ratio was 0.50%and hydrolysis time was 20min.According to the condition，the dispersity stationarity of the hydrolysates achieved 96.3%，viscosity was 3.2mPa·s，protein molecular size was 604.6nm.The variation trend of dispersity stationarity，viscosity and the molecular size of the hydrolysates were not synchronization.

wheat gluten；limited enzymolysis；dispersity stationarity；viscosity；protein partical size

TS239

A

1002-0306（2012）05-0119-05

2010－12－28

王章存（1963－），男，教授，博士，主要從事糧油植物蛋白和食品生物技術(shù)研究。

鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士基金項(xiàng)目（2007BJ0016）。