劉 潔，陳 芳，胡小松

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052）

甘氨酸與丙烯酞胺高溫反應(yīng)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性

劉 潔1，2，陳 芳1，*，胡小松1

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052）

丙烯酰胺是食品加熱過程中生成的一種具有潛在致癌性的有毒化合物，前期研究表明甘氨酸對丙烯酰胺的生成具有抑制作用。為了探明此方法的安全性，將丙烯酰胺/甘氨酸模擬體系在高溫下發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物與丙烯酰胺的細(xì)胞毒性進(jìn)行初步評價(jià)，應(yīng)用倒置顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果一致表明對于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y），在低于100g/mL的濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物的毒性作用明顯小于丙烯酰胺。

丙烯酰胺，甘氨酸，反應(yīng)產(chǎn)物，細(xì)胞毒性

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是食品熱加工過程中形成的一種化學(xué)污染物。AA已經(jīng)被證明是一種對人體具有神經(jīng)毒性的化合物，且被國際癌癥機(jī)構(gòu)列為2A類致癌物，動物實(shí)驗(yàn)表明具有生殖毒性和基因毒性[1]。2002年瑞典科學(xué)家首次報(bào)道AA在食品中廣泛存在，尤其在富含碳水化合物的高溫加工食品中含量極為豐富，油炸馬鈴薯片中甚至高達(dá)4000μg/kg[2]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織規(guī)定的飲用水中AA的限值0.5μg/L[3]。2002年兩篇關(guān)于熱加工過程中AA形成機(jī)理的文章相繼在Nature雜志上發(fā)表，證明美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）是AA形成的途徑[4-5]，此結(jié)論逐漸被眾多研究學(xué)者證實(shí)和接受，許多研究表明食品加工過程中添加甘氨酸對丙烯酰胺有抑制作用[6-8]。本課題組前期研究確定了高溫加熱條件下甘氨酸在模擬體系中抑制丙烯酰胺的反應(yīng)產(chǎn)物和反應(yīng)途徑[9]。甘氨酸在食品加工中能對味感起緩沖作用，增加食品的營養(yǎng)，并具有抗氧化和防腐作用[10]。對于富含甘氨酸的膠原蛋白，甘氨酸還有可能作為食品內(nèi)源性物質(zhì)抑制丙烯酰胺的環(huán)氧化作用，降低丙烯酰胺的毒性。對于甘氨酸與丙烯酰胺反應(yīng)生成的新物質(zhì)，需要與丙烯酰胺的毒性相比，只有毒性更小或無毒，通過添加甘氨酸抑制丙烯酰胺的生成才有實(shí)際意義。本文通過體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平比較新產(chǎn)物與丙烯酰胺的細(xì)胞毒性，即通過觀察細(xì)胞形態(tài)和傳統(tǒng)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)法來檢測和比較產(chǎn)物與丙烯酰胺對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）的毒性，既是對甘氨酸抑制丙烯酰胺方法安全性評價(jià)的基礎(chǔ)性探索，又是明確此方法在實(shí)際食品加工中意義的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）標(biāo)準(zhǔn)品 純度＞99.8%，美國Sigma公司；甘氨酸（Glycine，Gly） 標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99%，美國Amresco公司；反應(yīng)產(chǎn)物 RP－1amp;RP－2，純度＞97%（液相分離）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Gibco公司；臺盼藍(lán)染色劑、胰蛋白酶 美國Sigma公司；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH－SY5Y） 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。

XDOS－1B倒置生物顯微鏡 重慶光電有限公司；WMV－1000微視攝像頭系統(tǒng) 北京微視新紀(jì)元科技公司；SW－CJ－2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；37℃CO2培養(yǎng)箱 日本SANYO公司；SZ－97自動三重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠；GR－229EX（SG）電冰箱 日本TOSHIBA公司；MLS2420/2420U全自動殺菌釜 日本SANYO公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Gly與AA高溫反應(yīng)產(chǎn)物的制備 準(zhǔn)確稱取Gly和AA各8mmol，量取50mL超純水，加入耐壓反應(yīng)釜中，將密閉的反應(yīng)釜置于150℃油浴中加熱，反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束時立即將反應(yīng)液倒入冰水浴中的試管里，以阻止進(jìn)一步的反應(yīng)。應(yīng)用HPLC/ESI－MS、IT－TOF和NMR，對AA/Gly模擬體系在加熱條件下生成的兩個穩(wěn)定產(chǎn)物（RP－1amp;RP－2）進(jìn)行分離與鑒定，確定其分別是C5H10N2O3（RP－1）和C8H15N3O4（RP－2）[11]。反應(yīng)產(chǎn)物用半制備液相色譜分離制備，以示差折光檢測器檢測。液相分離條件：MP C18柱，21.5×250mm，0.45μm，0.5%甲酸水溶液洗脫，流速10mL/min，進(jìn)樣量100μL。每個化合物的溶液收集之后冷凍干燥成白色粉末。

1.2.2 SH－SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) SH－SY5Y細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，其中含有100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素，培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶（容量：105mL；表面積：35cm2；蓋類型：普通螺旋蓋）中，于含5%的CO2，溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為空白組：僅含培養(yǎng)液；對照組：培養(yǎng)液和SH－SY5Y細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組：培養(yǎng)液和SHSY5Y細(xì)胞，分別添加不同濃度的AA、RP－1、RP－2。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 收集對數(shù)期SHSY5Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104個細(xì)胞/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置于含5%的CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在96孔板的相應(yīng)孔中加入100μL濃度分別為200、100、50μg/mL的RP－1，對比加入同樣濃度和體積的RP－2和AA，每個濃度設(shè)3個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞存活率檢測 應(yīng)用臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的不同樣品對培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響。將SHSY5Y細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，濃度調(diào)至5×104個細(xì)胞/mL，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔500μL。在24孔板每孔中，加500μL用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的樣品RP－1、RP－2、AA（100、50、25、12.5μg/mL），37℃下再培養(yǎng)48h。吸盡孔中細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加0.25%胰蛋白酶將孔底覆蓋，37℃下作用2min，吸盡孔內(nèi)胰蛋白酶，加細(xì)胞培養(yǎng)液500μL，吹打均勻，每孔加500μL 0.4%臺盼藍(lán)染色液，混合均勻，將染色后培養(yǎng)液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，穩(wěn)定2min觀察，計(jì)數(shù)200個細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)染色與不染色細(xì)胞，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。未染色的為活細(xì)胞，染色的為死細(xì)胞，死細(xì)胞呈藍(lán)色，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=未染色細(xì)胞/（染色細(xì)胞數(shù)+未染色細(xì)胞數(shù)）×100%

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）表示，SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，比較各樣品不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間及與對照組的差異，以p＜0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理后細(xì)胞形態(tài)變化

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Cell morphology observed under inverted microscope

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞對RP－1、RP－2、AA具有不同的敏感性。對照組細(xì)胞貼壁生長良好，形態(tài)正常，邊緣清晰，多角形排列呈鋪路石樣，細(xì)胞間結(jié)合緊密、無縫隙。觀察50μg/mL組，AA作用的細(xì)胞已有部分形態(tài)發(fā)生明顯改變，明顯可見細(xì)胞圓縮，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞間結(jié)合欠緊密。RP－1和RP－2作用的細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，細(xì)胞貼壁生長良好，尤其是RP－2作用的細(xì)胞幾乎與對照組一樣，RP－1作用的細(xì)胞有個別發(fā)生圓縮。對于100μg/mL組，AA作用的細(xì)胞幾乎全部圓縮，完全失去原有特點(diǎn)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見到細(xì)胞碎片。RP－1和RP－2作用的細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長良好，細(xì)胞邊緣仍然較清晰，但可見少數(shù)細(xì)胞圓縮。在200μg/mL組中，AA作用的細(xì)胞，數(shù)量繼續(xù)減少，可見懸浮死細(xì)胞，細(xì)胞碎片增多；RP－1作用的細(xì)胞多數(shù)形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞圓縮，細(xì)胞間結(jié)合不緊密；RP－2作用的細(xì)胞仍然貼壁生長良好，可見少數(shù)細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生改變。由此可明顯判斷出RP－1和RP－2對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用明顯低于AA。因此，從細(xì)胞毒性上判斷，添加Gly抑制AA的方法引起新安全風(fēng)險(xiǎn)的可能性較小。

2.2 樣品對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

表1 不同濃度的樣品作用下SH－SY5Y細(xì)胞的存活率（%）Table 1 SH－SY5Y cell survival rate with different samples concentration（%）

臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)在顯微鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。因?yàn)榧?xì)胞死亡時，臺盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色，而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色細(xì)胞的時間不宜過長，否則部分活細(xì)胞也會著色，干擾計(jì)數(shù)。

結(jié)果顯示，沒有樣品作用的對照組的細(xì)胞存活率為98.5%±0.21%。對于每個樣品，細(xì)胞存活率均隨著樣品濃度的升高而降低。RP－1和RP－2各個濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率均比AA相對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率高。暴露于AA高劑量組的細(xì)胞存活率比低劑量組的細(xì)胞存活率降低高達(dá)65%，而暴露于RP－1和RP－2高劑量組的細(xì)胞存活率比低劑量組的細(xì)胞存活率降低不足20%。當(dāng)樣品濃度為50μg/mL和100μg/mL時，暴露于RP－1和RP－2的細(xì)胞存活率比暴露于AA的細(xì)胞存活率高50%以上。在臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)中，對于同一樣品不同濃度之間比較時，AA、RP－1、RP－2各個濃度的細(xì)胞存活率之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。對于同一濃度不同樣品進(jìn)行比較時，低濃度12.5μg/mL實(shí)驗(yàn)組中AA、RP－1、RP－2各組的細(xì)胞存活率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.01）；而在25、50、100μg/mL實(shí)驗(yàn)組，AA、PR－1、RP－2的細(xì)胞存活率之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。每個樣品的不同濃度與對照組比較時，AA各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與對照組相比，只有低濃度的12.5μg/mL實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.01），其他實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。對于RP－1和RP－2，只有高濃度的50μg/mL和100μg/mL實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與對照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。

3 結(jié)論

將AA/Gly模擬體系在高溫下反應(yīng)的產(chǎn)物RP－1和RP－2與AA的細(xì)胞毒性進(jìn)行比較，應(yīng)用倒置顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，以及臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測樣品對細(xì)胞存活率的結(jié)果一致表明，對于SH－SY5Y細(xì)胞在低于100μg/mL的濃度范圍內(nèi)，RP－1和RP－2的毒性作用明顯小于AA。

通過體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞水平比較RP－1和RP－2與AA的毒性，對甘氨酸在食品加工中控制AA的毒性進(jìn)行了基礎(chǔ)性探索，初步明確了甘氨酸抑制AA的方法在實(shí)際食品加工中的意義，以促進(jìn)Gly抑制AA方法在食品生產(chǎn)加工中的應(yīng)用與推廣。

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The cytotoxicity of products from heating glycine and acrylamide

LIU Jie1，2，CHEN Fang1，*，HU Xiao-song1
（1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.College of Food Science and Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China）

Acrylamide is known to be a neurotoxic，genotoxic，and a potentially carcinogenic compound. Carbohydrate-rich foods which were heated or fried at high temperatures contained relatively high levels of acrylamide.Previous studies had shown that glycine could inhibit the formation of acrylamide in model systems and food matrix，and the reaction products（RP-1 and RP-2）of acrylamide elimination in model systems by glycine were obtained.Different cytotoxicity has been observed in differentiated human neuroblastoma（SHSY5Y）cells during exposure to acrylamide，RP-1 and RP-2.When the concentration of compound was less than 100μg/mL，the survival rates of cells exposure to RP-1 and RP-2 were greater than that of cells exposure to acrylamide by Trypan blue coloring method.

acrylamide；glycine；reaction products；cytotoxicity

TS201.2

A

1002-0306（2012）03-0049-03

2011－03－07 *通訊聯(lián)系人

劉潔（1979－），女，博士，講師，研究方向：食品安全。

國家自然科學(xué)基金（31071554）；國家十一五支撐計(jì)劃課題（2009BADB9B07）。