楊雪，勾文峰，丁蕾，肖麗君，高野康雄，鄭華川

（1.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究室，病理與病理生理研究所，沈陽 1 1 0 0 0 1；2.解放軍4 6 3醫(yī)院檢驗科，沈陽1 1 0 0 4 2；3.承德醫(yī)學院基礎部免疫教研室，河北 承德 0 6 7 0 0 0；4.日本神奈川縣立癌中心臨床研究所，橫濱 2 4 1-0 8 1 5）

原位檢測核酸的病理學方法主要有原位雜交（in situ hybridization，ISH）和原位 PCR（in situ polymerase chain reaction，ISP）。ISH利用放射性或非放射性標記的已知核酸探針，通過放射自顯影或非放射檢測系統(tǒng)在組織、細胞及染色體上檢測特異DNA或RNA序列，是一種直接、簡便的研究基因定位和表達的方法［1］。ISP通過PCR技術把固定在細胞內(nèi)的RNA或DNA進行原位擴增，對靶核苷酸進行定位、定性、定量分析，該方法敏感性高、特異性強，能在組織細胞原位進行低拷貝數(shù)基因定性［2］。標準ISH的探測敏感度要求每個細胞中大約含有1 000個拷貝模板，而ISP則可檢測到細胞中僅幾個拷貝模板的核酸［3］。如果在ISP后再進行ISH可以大大提高組織切片上核酸檢測敏感性，本研究擬探討該方法的建立及操作注意事項，說明其在病理形態(tài)學檢測中的應用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境下，培養(yǎng)結直腸癌細胞系HCT115（低分化型腺癌）（日本東京物化研究所）或JC病毒感染的神經(jīng)母細胞瘤（JCI）細胞（由北海道大學Sawa教授饋贈）。收集細胞，PBS洗2次，-80℃凍存，或常規(guī)制備成石蠟切片。

1.2 病理標本

收集日本富山大學醫(yī)學部胃癌和肺癌組織各100例，10%甲醛固定，脫水、透明、浸蠟和包埋，制備成石蠟塊，4 μm切片，展片到多聚賴氨酸處理的載玻片上烤片。所有患者手術前均未經(jīng)放療、化療和生物治療，獲得患者及家屬知情同意和大學倫理委員會批準。

1.3 探針制備

提取HCT115細胞RNA，AMV酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，制備地高辛標記的beclin 1和SERCA3探針；以pBluescrip K（+）-T抗原質(zhì)粒為模板制備地高辛標記的JCV T抗原探針。所用引物見表1。100 μL PCR反應體系中含引物 F 1 μmol/L，引物 R 1 μmol/L，MgCl22 mmol/L，10×PCR buffer 10 μL，DIG-11-dUTP（Roche Diagnostics，德國）200 mmol/L，cDNA 模板100 ng，Taq聚合酶2 U。PCR反應條件：95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，循環(huán)30次。Reg IV探針長度為 122 bp （682~803，GI：36054181），PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后膠回收純化。

1.4 ISH

4 μm厚切片脫蠟后，經(jīng)胃0.05%蛋白酶（0.2 N HCl，pH2.0）37℃消化30 min，乙醇梯度脫水晾干。每張切片滴加1︰50稀釋的20 μL地高辛標記的探針用雜交液（22 mmol/L Tris-HCl pH7.4，2.75 mmol/L EDTA、660 mmol/L NaCl、16 Denhardt solution、5.5%硫酸葡聚糖、0.33%二甲基亞砜、0.55%ethoquad 18/25和44%去離子甲酰胺），覆以蓋玻片，95℃5 min，37℃過夜。TTBS沖洗10 min，滴加抗地高辛—抗血清堿性磷酸酶（Roche Diagnostics，德國），37℃20 min。沖洗5 min，浸入solutionⅡ（100 mmol/L Tris-HCl，pH9.5，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2），室溫15 min，孵育抗地高辛—抗血清堿性磷酸酶過夜。NBT/BCIP顯色液（紫色）或Fuchsin（紅色）染色，核快紅（粉紅色）或甲基綠（綠色）復染。

1.5 ISP

10 μm 厚切片經(jīng)蛋白酶 K（20 μg/mL，Dako）37℃消化15 min。PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定，2×SSC沖洗。滴加125 μL PCR反應體系（0.2 μmol/L引物，序列見表 1，0.125 nmol/L DIG-11-dUTP、2.5 mmol/L MgCl2，1×PCR buffer，6.25 U Taq 聚合酶），蓋膜覆蓋，94 °C 3 min 預變性，92 °C 15 s，55 °C 15 s，72 °C 30 s，循環(huán) 15 次，72 °C 5 min。擴增產(chǎn)物長度約100 bp。2×SSC 沖洗切片，滴加封閉液（100 μg/mL 鮭魚精子 DNA，100 μg/mL 酵母 tRNA，5%BSA 溶于PBS中）作用1 h。檢測和復染方法與ISH相同。

表1 制備探針或I S P所需引物T a b.1 P r i me r s e q u e n c e s f o r p r o b e o r I S P

2 結果

在ISH中，我們獲得的地高辛標記探針DNA為單一條帶，產(chǎn)物經(jīng)過測序確認。切片經(jīng)過酶消化后進行預雜交，使切片上細胞DNA雙鏈解開。探針混入雜交液前要加熱變性后立刻置于冰上，保證探針保持單鏈狀態(tài)。甲酰胺雜交液中42℃雜交過夜后，洗掉雜交液并加入抗地高辛AP抗體，顯色前經(jīng)過堿性緩沖液改變切片上組織的pH值，使AP在最佳pH值發(fā)揮分解底物NBT/BCIP或Fuchsin的作用，核快紅或甲基綠復染后直接干燥，然后浸入二甲苯中透明封片。切記甲基綠復染切片不能經(jīng)過乙醇脫水，因為甲基綠溶于乙醇。如圖1所示，JCV T抗原存在于JCI細胞的細胞核中，而在胃癌和肺癌細胞中未檢測到JCV T抗原。如圖2所示，beclin 1和SERCA3mRNA陽性信號也見于結腸癌和癌旁黏膜上皮細胞質(zhì)中。

在ISP過程中，必須控制蛋白酶降解的時間，過度降解可能導致細胞形態(tài)受損。PCR反應液放入蓋膜里之前要加熱排除混合物中的氣體后再加入Taq DNA聚合酶。如擴增的是組織切片，可將PCR反應液置于封口膜中。如擴增對象是細胞，還可以借助組織培養(yǎng)蓋玻片操作。反應后，顯示系統(tǒng)和ISH相同。如圖1所示：JCV T抗原DNA存在于JCI細胞核中。此外，在肺泡上皮細胞和肺癌細胞核、胃癌及癌旁黏膜細胞核中也發(fā)現(xiàn)了JCV T抗原陽性信號（圖 3）。

3 討論

ISH探針的制備主要采用缺口平移法、隨機引物法或PCR擴增合成，同位素標記探針的制備常用末端標記法。目前認為利用地高辛標記UTP進行PCR擴增較簡便、安全，適合大多數(shù)實驗室。ISH最關鍵的步驟是分子雜交，根據(jù)分子雜交的原理，在雜交過程中必須讓探針和目標核酸處盡量處于單鏈狀態(tài)。本研究所用雜交液中的甲酰胺可破壞氫鍵，使核酸解開雙螺旋狀態(tài)，硫酸葡聚糖的DNA有濃縮作用，可將雜交反應速度提高10倍以上。封阻DNA濃度通常為探針DNA的1~100倍，作用是雜交掉探針中的相似序列，阻止探針DNA與非目標DNA的粘連。雜交應在25℃（基因組ISH一般是37℃）、避光恒溫條件下進行，持續(xù)時間12~20 h。在此期間應注意保濕，可將濕盒置于42℃溫箱中，或?qū)㈦s交爐上面的面板條浸濕。在檢測mRNA表達的過程中，雜交過夜前一定要盡量保持RNase-free的操作條件。本研究中，在JCI細胞核中成功檢測到JCV T抗原DNA，而在肺癌和胃癌組織中則未檢測到，可能因其檢測感度較低所致［4，5］。在結直腸癌細胞質(zhì)中我們也檢測到beclin 1和SERCA3mRNA的表達。我們的經(jīng)驗提示，如果結直腸癌組織樣品進行RT-PCR 30個循環(huán)可以檢測到目的基因，就能利用ISH成功檢測到其mRNA表達。

ISP既有分子雜交特異、靈敏的特點，同時又有組織細胞化學染色的可見性，且其應用范圍廣泛，可對特定基因（如癌基因、病毒基因）DNA、mRNA的表達進行定位、定性和定量［2］。本研究中，主要針對JCV T抗原DNA進行了ISP擴增，并在肺癌和胃癌細胞和癌旁正常細胞核中檢測到其陽性信號［3~5］。ISP與ISH不同之處在于組織切片在PCR前要進行細胞固定，旨在保存細胞形態(tài)結構，本研究使用的4%中性多聚甲醛固定效果比較好。固定時間以30~60 min為宜，時間過長可能導致核酸和蛋白交聯(lián)，影響PCR擴增效率。隨后的蛋白酶消化的目的是解除醛類固定劑所致的核酸與蛋白質(zhì)交聯(lián)，防止形成網(wǎng)絡性屏障結構，使得PCR反應試劑充分透入，同時也能更好地暴露DNA。PCR擴增產(chǎn)物長度不可過短或過長，產(chǎn)物太短容易擴散，而過長則擴增效率受影響。引物可用1對或多對，產(chǎn)物長度一般在100~200 bp。循環(huán)數(shù)應根據(jù)模板量進行適當調(diào)整，循環(huán)數(shù)過大可導致非特異性擴增，太小則易致假陰性。

本研究所用ISP為直接法，把標記核苷酸（如Dig-11-dUTP）直接混入PCR反應液中，隨著擴增的進行，標記的核苷酸直接摻入到PCR產(chǎn)物中。還可采用間接法ISP，原位核酸擴增后進行ISH檢測，可提高檢測敏感度和特異度，但耗時較多。此外，還可行原位反轉(zhuǎn)錄PCR擴增，應注意的是組織要經(jīng)過DNA酶處理去除細胞固有DNA，降低擴增模板噪聲。在顯色方面，無論ISH還是ISP，NBT/BCIP比Fuchsin的顯色要強，F(xiàn)uchsin顯色過5 min后形成沉淀。

總之，為了獲得敏感、特異和可信的結果，應根據(jù)研究條件選擇核酸的原位檢測技術，在實驗過程中要注意實驗原理和操作的關鍵點。本研究所建立的地高辛標記的ISH和ISP操作簡便、敏感度高，NBT/BCIP顯色和甲基綠復染的圖像清晰，適用于大多數(shù)實驗室。

［1］劉勇，楊海玉.原位雜交的技術關鍵及其應用［J］.江西醫(yī)學檢驗，2006，24（6）：560-562.

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