陳立思， 聞?wù)嬲? 蔡繼業(yè), 曾偉達， 劉運權(quán), 王 曼， 劉 偉*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，廣東廣州 510642； 2.廣州花卉研究中心，廣東廣州 510360)

4種兜蘭RubisCO的分離純化及酶學性質(zhì)初步研究

陳立思1，2， 聞?wù)嬲?, 蔡繼業(yè)1, 曾偉達2， 劉運權(quán)1, 王 曼1， 劉 偉1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，廣東廣州 510642； 2.廣州花卉研究中心，廣東廣州 510360)

采用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析與凝膠過濾層析的方法，分離純化得到硬葉(Paphiopedilummicranthum)、紫紋(P.purpurattum)、帶葉(P.hirsutissimum)和亨利(P.henryanum)4種兜蘭RubisCO的大、小亞基，相對分子量分別為51.5×103～54.5×103和15.0×103～16.0×103. 4種兜蘭RubisCO的羧化/加氧活性在pH8.0、溫度30 ℃時最高，其活性大小順序為硬葉兜蘭>紫紋兜蘭>亨利兜蘭>帶葉兜蘭，且紫紋兜蘭、亨利兜蘭的羧化/加氧活性比值相對高于硬葉兜蘭、帶葉兜蘭；硬葉兜蘭RubisCO的Km(RuBP)值最小.4種兜蘭RubisCO的特性反映了其不同的生理和生境特征.

兜蘭(Paphiopedilum); RubisCO; 分離純化; 酶學性質(zhì)

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶( E.C.4.1.1.39)(簡稱RubisCO)存在于葉綠體基質(zhì)中，是所有光合生物進行光合碳同化的關(guān)鍵性酶[1].目前，已經(jīng)從多種植物中分離純化了RubisCO，但有關(guān)兜蘭RubisCO的研究卻未見報道.兜蘭屬(Paphiopedilum)是蘭科(Orchidaceae)植物中最具特色的一個類群，得名于其呈兜狀的唇瓣，具有較高的觀賞和研究價值.由于野生兜蘭受到掠奪性采挖和貿(mào)易，導致數(shù)量急劇減少甚至滅絕.對野生兜蘭進行有效保護是一個亟待解決的問題，而對其光合作用關(guān)鍵酶RubisCO的研究可為研究其光合作用特性提供基礎(chǔ)，并能為其保護和栽培提供理論支持.

不同兜蘭對光照的要求不同，其光合作用特性也不同.本論文從硬葉、紫紋、帶葉和亨利4種兜蘭(Paphiopedilum)中分離純化RubisCO，并對該酶的部分特性進行研究,為認識兜蘭的光合作用特性，提高栽培效率提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料硬葉兜蘭(P.micranthum)、紫紋兜蘭(P.purpurattum)、帶葉兜蘭(P.hirsutissimum)和亨利兜蘭(P.henryanum)均為原生種，由華南農(nóng)業(yè)大學植物化控研究室提供.栽培條件為濕度60%以上，溫室有風機水簾降溫，棚頂覆蓋二層遮陽網(wǎng).

1.2 RubisCO的分離純化

取生長良好、濃綠色的兜蘭葉片，洗凈，晾干.稱取15～20 g，加入預冷的酶提取液(50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L MgCl2，0.5%的Gly，0.6% β-巰基乙醇，10 mmol/L的抗壞血酸，1% PVP，酶提取液的體積數(shù)/葉片質(zhì)量數(shù)=1/5)和少量石英砂，搗碎成勻漿，4層紗布過濾.得到的粗酶液經(jīng)飽和 (NH4)2SO4分段鹽析、Sephadex G-25換鹽、DEAE纖維素陰離子交換柱層析(0～4 ℃)、Sephadex G-200 凝膠過濾純化.

1.3 酶活性測定

RubisCO羧化活性的測定參照Racker的分光光度計法[2]，在最適的反應(yīng)條件下，每分鐘催化1 μmol CO2所需要的酶量定義為1個酶活單位(U). 加氧活性的測定方法為氧電極法[3].

1.4 蛋白純度檢測和分子量確定

參照趙永芳等介紹的方法[4]，采用不連續(xù)垂直板狀非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)檢測蛋白純度.利用SDS-PAGE測定亞基的分子量大小，根據(jù)標準蛋白質(zhì)分子量(Protein low molecular marker，TAKARA)的對數(shù)和泳動率呈線性關(guān)系而求出未知蛋白質(zhì)的分子量，其中泳動率=(蛋白質(zhì)遷移的距離/染料移動的距離)×(染色前凝膠的長度/脫色后凝膠的長度).

1.5 蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍G-250染色法，用牛血清蛋白(BSA)做標準蛋白.

1.6 酶動力學參數(shù)

RubisCO對底物二磷酸核酮糖(RuBP)的Km和Vmax測定方法采用雙倒數(shù)作圖法[4].

2 結(jié)果與分析

2.1 RubisCO的分離純化

粗酶液經(jīng)用體積分數(shù)為30%～50%的硫酸銨分段鹽析-DEAE陰離子交換(0.3 mol/L NaCl洗脫)-Sephadex G-200凝膠過濾的流程純化后，得到了純度達到85%以上的RubisCO酶蛋白(圖1)，純化倍數(shù)均達到5倍以上(表1).

1：粗酶液；2：硫酸銨沉淀后酶液；3：陰離子交換后酶液；4：凝膠過濾后酶液

表1 4種兜蘭RubisCO的純化Table 1 Purification of RubisCO from 4 species of Paphiopedilum

2.2 RubisCO亞基分子量確定

SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，4種兜蘭RubisCO的大、小亞基分別位于標準相對分子量蛋白66.4×103～44.3×103之間和20.1×103～14.3×103之間(圖2A).根據(jù)標準蛋白質(zhì)相對分子量的對數(shù)與泳動率之間的線性關(guān)系(圖2B)，計算出各種兜蘭RubisCO大、小亞基的相對分子量，范圍為51.5×103～54.5×103和15×103～16×103(圖2A)，與已報道的RubisCO的大、小亞基相對分子量范圍一致[5].

2.3 酶學性質(zhì)

硬葉和紫紋2種斑葉類兜蘭RubisCO的羧化活性和加氧活性顯著高于帶葉和亨利2種綠葉兜蘭，亨利兜蘭和紫紋兜蘭的羧化/加氧值則顯著高于帶葉兜蘭和硬葉兜蘭(表2).

4種兜蘭RubisCO對底物RuBP羧化活性的分析結(jié)果見表2，硬葉兜蘭RubisCO的Km值最小，對底物RuBP的親和力最高，帶葉兜蘭RubisCO的Km值最大，對底物RuBP的親和力最低；紫紋兜蘭RubisCO的Vmax/Km值最大，說明其對底物的專一性最強.

圖2 RubisCO大、小亞基分子量的確定

2.4 酶穩(wěn)定性

在30 ℃時，4種兜蘭RubisCO羧化活性均最大，除帶葉兜蘭外，其它3種兜蘭的羧化活性在溫度小于25 ℃和大于30 ℃時下降明顯(圖3A)；在pH 8測得的羧化活性最大，在pH 6，幾乎檢測不到RubisCO的羧化活性，此時接近RubisCO等電點，RubisCO解離為大亞基核L8和游離小亞基[6]；在pH 3～5時，RubisCO羧化活性重新增加，其增幅小于pH 7～9的增幅值(圖3B).以上結(jié)果表明帶葉兜蘭RubisCO的熱穩(wěn)定性最強，另外3種兜蘭的熱穩(wěn)定性無明顯差異.而硬葉和紫紋兜蘭的活性受pH影響的程度大于亨利和帶葉兜蘭.

圖3 4種兜蘭RubisCO的溫度(A)和pH(B)穩(wěn)定性

3 討論

RubisCO是植物可溶蛋白中含量最高的蛋白，達到50%左右. SUREZ等[7]利用陰離子交換的方法從小麥中分離純化的RubisCO純度高于96%，回收率高于75%，目前缺乏兜蘭RubisCO分離純化的報道.本研究參照其它植物RubisCO的分離純化方法，針對兜蘭葉片多糖、酚類物質(zhì)含量高的特點，在提取液中加入PVP去除多糖；并利用陰離子交換和凝膠過濾的方法，從4種兜蘭中成功分離到了RubisCO.相比前述小麥RubisCO的分離純化，整個過程耗時較長，回收率較低(35%～42%)，但得到的RubisCO純度達85%以上，適用于酶學性質(zhì)的進一步研究.

RubisCO具有雙重功能：在CO2分壓高時, 使二磷酸核酮糖(RuBP)羧化, 產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，推動C3 碳循環(huán)；在O2分壓高時，產(chǎn)生1分子的PGA和1分子的磷酸乙醇酸而引起C2氧化循環(huán)及光呼吸，即酶的氧化活性.在酶動力學參數(shù)上，Km(RuBP)和Vmax的大小可以反映RubisCO羧化/氧化能力的高低.4種兜蘭RubisCO對底物RuBP的Km值，大小依次為帶葉兜蘭(1.26 mmol/L)>亨利兜蘭(1.19 mmol/L)>紫紋兜蘭(0.94 mmol/L)>硬葉兜蘭(0.93 mmol/L)，4種兜蘭Km值之間沒有顯著性差異，但與陳根云[4]提供的參考值20～25 μmol/L相比，RubisCO對底物RuBP的Km值增加，說明兜蘭RubisCO對底物RuBP的親和能力不高，與兜蘭屬植物光合速率低相符合[8].而斑葉類兜蘭紫紋和硬葉的Vmax值顯著高于綠葉類兜蘭帶葉和亨利，Vmax與CO2固定速率有關(guān)，說明斑葉類兜蘭對CO2的固定速率高于綠葉類兜蘭.

與Km值對應(yīng)的4種兜蘭RubisCO的羧化/加氧活性比值依次為硬葉兜蘭>紫紋兜蘭>亨利兜蘭>帶葉兜蘭，結(jié)合其形態(tài)和生境特征，斑葉類兜蘭高于綠葉類兜蘭，斑葉類兜蘭生長在堿性土中，Km高于酸性土中的綠葉類兜蘭.CO2濃度是RubisCO活性的關(guān)鍵限制因素[9]，紫紋兜蘭和亨利兜蘭的羧化/加氧值相對高于硬葉兜蘭和帶葉兜蘭，說明二者在高濃度CO2的環(huán)境下能更好地進行光合作用，這與前述2類兜蘭Vmax之間的差異一致.4種兜蘭RubisCO的羧化活性、羧化/加氧活性比都低于水稻和小麥等作物，陰生環(huán)境下的兜蘭的光合作用能力較低，可能與其對生長環(huán)境的適應(yīng)有關(guān).

植物RubisCO在體內(nèi)的最大活性溫度多為20～30 ℃，而在體外失活溫度為50 ℃以上[10].本研究中4種兜蘭的RubisCO在pH 8、葉溫30 ℃時羧化活性最大，對應(yīng)空氣溫度25 ℃，為其最適生長溫度.在pH為3～5的時候，4種兜蘭RubisCO羧化活性重新回到一個小的高峰，此時對應(yīng)紫紋兜蘭最適生長環(huán)境的pH值(4.1～5.1)[11]；帶葉兜蘭與紫紋兜蘭同屬酸性土壤類型，其RubisCO在pH 5時達到最大羧化活性.

以上研究說明，4種兜蘭的RubisCO特性反映了其不同的生境和生理特征.兜蘭具有極高的觀賞價值，在栽培過程中缺乏生理特性研究，以致目前無法實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)；另一方面，市場的需求導致野生兜蘭資源的過度挖掘，廣東等野生兜蘭分布區(qū)中一些品種已經(jīng)瀕臨滅絕[12].因此，從生產(chǎn)和植物保護兩方面來說，對兜蘭光合生理等特性的了解是為提高栽培技術(shù)和采取有效保護措施的理論前提，本研究對4種兜蘭RubisCO的研究將為進一步了解各兜蘭的生理特征和光合特性，指導栽培管理提供理論基礎(chǔ).

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PrimaryStudyontheIsolationandEnzymaticPropertiesofRubisCOfromFourSpeciesofPaphiopedilum

CHEN Lisi1,2, WEN Zhenzhen1, CAI Jiye1, ZENG Weida2, LIU Yunquan1, WANG Man1, LIU Wei1*
(1.College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2. Guangzhou Flower Research Center, Guangzhou 510360, China)

RubisCOs were isolated and purified fromPaphiopedilummicranthum,P.purpurattum,P.hirsutissimumandP.henryanumby (NH4)2SO4precipitation, anion exchange and gel filtration chromatography in succession. The molecular weights of their large and small subunits were 51.5×103～54.5×103and 15.0×103～16.0×103, respectively. Their zymologic characters were further studied. The results showed that these four RubisCOs from differentPaphiopedilumhad the highest activity at pH 8.0 and 30 ℃, and the descending order of RuBPcase/oase activity wasP.micranthum,P.purpurattum,P.henryanumandP.hirsutissimum, and the RuBPcase/oase activity ratio ofP.purpurattumandP.henryanumwere higher than that ofP.micranthumandP.hirsutissimum. TheKm(RuBP) value ofP.Micranthum’sRubisCO is the lowest in the fourPaphiopedilumspecies, which indicated that its affinity to RuBP is the highest. The physiological and habitat characteristics of the four differentPaphiopedilumwere reflected by properties of RubisCOs isolated from them, which provided a basis for further investigation of their photosynthetic physiology.

2012-04-25

廣東省農(nóng)業(yè)科技計劃項目(2008-810)；廣東省科技計劃項目(2008B02040006)

*通訊作者，liuwei@scau.edu.cn

1000-5463(2012)03-0112-04

Q55

A

10.6054/j.jscnun.2012.06.024

Keywords：Paphiopedilum; RubisCO; isolation; enzymatic properties

【責任編輯 成 文】