吳方猛， 何懷東， 顏君嵐， 楊丹菁， 靖元孝*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631;2. 廣州市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，廣東廣州 510620)

細(xì)菌菌株MS1的鉛鋅抗性和吸附性能研究

吳方猛1， 何懷東1， 顏君嵐1， 楊丹菁2， 靖元孝1*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631;2. 廣州市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，廣東廣州 510620)

從廣東凡口鉛鋅尾礦分離到1株重金屬抗性細(xì)菌菌株MS1，該菌株對(duì)Pb2+和Zn2+的最大耐受濃度分別為4、40 mmol/L.菌株MS1能在17～37 ℃和pH 3～13條件下生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度和pH分別為27 ℃和7.菌株MS1對(duì)高滲透環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，最適生長(zhǎng)鹽度為4%.當(dāng)Pb2+和Zn2+濃度分別為2、10 mmol/L時(shí)，60 h內(nèi)菌株MS1對(duì)Pb2+和Zn2+的最大吸附量和最大吸附率分別為13.9、20.0 mg/g和23.3%、25.2%.菌株MS1對(duì)Zn2+的吸附能力大于對(duì)Pb2+的吸附能力.

Zn2+; Pb2+; 重金屬抗性; 細(xì)菌; 吸附作用

近年來(lái)，各種工業(yè)(如采礦、冶煉、電鍍等)廢水和固體廢棄物的滲出液直接排入水體，致使水體含有較高含量的重金屬.在長(zhǎng)期受到重金屬污染的環(huán)境中必然會(huì)存在大量的能適應(yīng)重金屬污染環(huán)境并且對(duì)重金屬具有較強(qiáng)抗性的微生物類群.重金屬不能被微生物降解，但是微生物可以吸附、轉(zhuǎn)化和溶出重金屬[1].水體重金屬污染的修復(fù)方法通常采用物理和化學(xué)方法，如化學(xué)沉淀法、離子交換法、膜分離法等.近年來(lái)，水體重金屬污染的微生物修復(fù)成為研究的熱點(diǎn)，其中微生物吸附法受到了廣泛關(guān)注[2-4].曹小紅等[3]從重金屬污染土壤中分離篩選到2株耐受和吸附Pb的細(xì)菌菌株G和Y，菌株G和Y的凍干菌體對(duì)Pb的吸附量分別為126.42、61.08 mg/g，濕菌體對(duì)Pb的吸附率分別為94.66%和99.74%.張漢波等[4]從鉛鋅礦分離到的細(xì)菌菌株CS13，Pb2+和Zn2+對(duì)其最小抑制濃度分別為32、8 mmol/L，凍干菌體對(duì)Pb和Zn的吸附量平均達(dá)到了400、80 mg/g.本實(shí)驗(yàn)從廣東凡口鉛鋅尾礦分離篩選重金屬抗性細(xì)菌，并研究其重金屬吸附能力，為水體重金屬污染的微生物修復(fù)提供參考.

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基和試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂 18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4±0.2，液體培養(yǎng)基不加瓊脂.

重金屬溶液：Pb2+和Zn2+溶液分別用ZnSO4·7H2O和Pb(NO3)2配制.

1.2 重金屬抗性菌株的分離及其對(duì)重金屬的抗性

從廣東韶關(guān)凡口鉛鋅礦廢棄地距地表5～10 cm采集土壤樣品，土壤樣品采用梯度稀釋法制菌懸液，取0.2 mL菌懸液分別涂布于含有5 mmol/L Zn2+和1.5 mmol/L Pb2+的培養(yǎng)基表面，28 ℃下培養(yǎng)待長(zhǎng)出菌落后挑取細(xì)菌單菌落，經(jīng)多次純化后，轉(zhuǎn)至斜面4 ℃保藏.然后進(jìn)一步研究篩選到的抗性菌株對(duì)Zn2+和Pb2+的抗性，用最小抑制濃度(能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的最低藥物濃度)來(lái)表示細(xì)菌對(duì)重金屬的抗性.

1.3 溫度、pH和鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

供試菌株活化24 h后，接種到液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(150 r/min) 2 d，取10 mL菌懸液到200 mL液體培養(yǎng)基中，分別在溫度為17、22、27、32、37 ℃，pH為3、5、7、9、11、13，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、2%、4%、6%、8%和10%的條件下，搖床培養(yǎng)(150 r/min)3 d，用UV-1206型分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的OD600，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù).

1.4 Zn2+、Pb2+對(duì)菌株生長(zhǎng)曲線的影響

供試菌株活化24 h后，接種到液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(150 r/min)2 d，取10 mL菌懸液到200 mL液體培養(yǎng)基中，分別在Zn2+濃度為0、10、20、30、40 mmol/L和Pb2+濃度為0、1、2、3、4、5 mmol/L條件下?lián)u床培養(yǎng)(150 r/min)，每隔4 h用UV-1206型分光光度計(jì)測(cè)定不同金屬濃度下菌懸液的OD600.每個(gè)處理3個(gè)重復(fù).

1.5 菌株的重金屬吸附特性

供試菌株活化24 h后，接種到液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(150 r/min)2 d，取10 mL菌懸液到Zn2+濃度為10 mmol/L和Pb2+濃度為2 mmol/L的液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床(150 r/min)培養(yǎng).每隔10 h，7 000 r/min離心10 min，上清液中的重金屬含量使用原子吸收分光光度計(jì)(Z-2000)測(cè)定，同時(shí)收集烘干菌體，計(jì)算菌體對(duì)重金屬的吸附量和吸附率.

吸附量=(C1-C2)V/M,

吸附率=(C1-C2)/C1×100%,

式中，C1表示溶液初始的重金屬離子質(zhì)量濃度(mg/L)，C2表示上清液中殘余的重金屬離子質(zhì)量濃度(mg/L)，V表示吸附溶液的體積(L)，M表示菌體干質(zhì)量(g).

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb2+和Zn2+抗性菌株的分離

利用含Pb2+和Zn2+的培養(yǎng)基來(lái)分離篩選重金屬抗性菌株，在Pb2+濃度為1.5 mmol/L和Zn2+濃度為5 mmol/L培養(yǎng)基分別得到2株和4株細(xì)菌，菌株編號(hào)分別為MS1、MS2、MS3、MS4、MS5和MS6.

2.2 細(xì)菌對(duì)重金屬的抗性

菌株MS1對(duì)Pb2+和Zn2+的抗性最強(qiáng)(表1、表2)，最小抑制濃度分別為4、40 mmol/L.因此，選擇菌株MS1作為抗性最佳的功能菌株，進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性及其對(duì)Pb2+和Zn2+的吸附能力.

表1 菌株對(duì)Pb2+的抗性Table 1 The Pb2+-resistance of bacterial strains

注：“+++”表示供試菌株生長(zhǎng)良好，“++”表示生長(zhǎng)較好，“+”表示生長(zhǎng)一般，“+-”表示生長(zhǎng)差，“-”表示不生長(zhǎng)，下表同.

表2 菌株對(duì)Zn2+的抗性Table 2 The Zn2+-resistance of bacterial strains

2.3 溫度、pH和鹽度對(duì)菌株MS1生長(zhǎng)的影響

菌株MS1能在17～37 ℃生長(zhǎng)良好，最適溫度為27 ℃(圖1A).菌株MS1在較廣泛的pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在pH 5～11生長(zhǎng)良好，最適pH為7(圖1B).菌株MS1廣泛地生長(zhǎng)在不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的液體培養(yǎng)基中，從0.1%到10%都能生長(zhǎng)，最適鹽度為4%(圖1C).

圖1 溫度、pH和鹽度對(duì)菌株MS1生長(zhǎng)的影響

2.4 Pb2+和Zn2+對(duì)菌株MS1生長(zhǎng)的影響

MS1菌株生長(zhǎng)在沒(méi)有加重金屬的對(duì)照組中，其延滯期大約為4 h(圖2)，最大OD600值為1.17；當(dāng)Pb2+濃度為1、2、3 mmol/L時(shí)，菌株MS1生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組基本相同，最大OD600值分別為1.12、1.05和1.01，表明菌株生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響；當(dāng)Pb2+濃度為4、5 mmol/L時(shí)，延滯期延長(zhǎng)，分別為24、40 h左右，最大OD600值分別為0.93和0.43，表明菌株MS1的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制作用.

圖3表明，當(dāng)Zn2+濃度為10、20、30、40 mmol/L 時(shí)，延滯期延長(zhǎng)，大約在12～16 h左右， 最大OD600值分別為1.11、1.05、0.98和0.79.

圖2 Pb2+對(duì)菌株MS1生長(zhǎng)的影響

圖3 Zn2+對(duì)菌株MS1生長(zhǎng)的影響

總之，當(dāng)Pb2+濃度低于3 mmol/L和Zn2+濃度低于30 mmol/L時(shí)，不影響菌株MS1的生長(zhǎng)，超過(guò)這個(gè)范圍時(shí)對(duì)菌株生長(zhǎng)影響較大.

2.5 菌株MS1吸附重金屬特性

細(xì)菌培養(yǎng)10～30 h內(nèi)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體活性強(qiáng)，吸附量增長(zhǎng)較快，隨后細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期和衰亡期，吸附量增長(zhǎng)較慢并逐漸趨于穩(wěn)定，最大值分別達(dá)到13.9、20.0 mg/g.此外，整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中菌株MS1對(duì)Zn2+的吸附量要大于Pb2+，前者是后者的1.5倍(圖4).

菌株MS1對(duì)重金屬Pb2+和Zn2+的吸附率隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖而不斷增加.10～30 h內(nèi)，吸附率快速上升，隨后增速稍有下降，60 h時(shí)菌株MS1對(duì)Pb2+和Zn2+的吸附率分別達(dá)到23.3%和25.2%.此外，整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中菌株MS1對(duì)Zn2+的吸附率要高于Pb2+(圖5).

圖4 菌株MS1對(duì)Pb2+和Zn2+的吸附量

圖5 菌株MS1對(duì)Zn2+和Pb2+的吸附率

3 討論

菌株MS1對(duì)重金屬Pb2+和Zn2+表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性，最小抑制濃度分別為4、40 mmol/L(表1、表2).在液體培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)Pb2+濃度低于3 mmol/L和Zn2+濃度低于30 mmol/L時(shí)，對(duì)菌株MS1生長(zhǎng)影響不大 (圖2、圖3).由此可見(jiàn)，菌株MS1對(duì)Zn2+和Pb2+有很強(qiáng)的抗性.張漢波等[4]、曹小紅等[3]分別分離到耐受Pb2+的細(xì)菌，PAGUELO等[5]分離的細(xì)菌Ochrobactrumsp.Zn2+、Pb2+對(duì)其的最小抑制濃度分別為10、7 mmol/L,XIE等[6]從銅礦分離細(xì)菌，其在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基對(duì)Zn2+最大耐受濃度分別為35、40 mmol/L.

微生物對(duì)Pb2+和Zn2+的抗性主要通過(guò)吸附固定、絡(luò)合、甲基化等作用方式產(chǎn)生.產(chǎn)氣克氏桿菌的抗重金屬菌株能使Zn2+、Pb2+和Hg2+形成不溶性的硫化物顆粒，沉淀在細(xì)胞外表面.許多微生物可以合成具有結(jié)合重金屬的胞內(nèi)蛋白，這種蛋白質(zhì)對(duì)Zn2+、Pb2+和Cu2+等重金屬有很強(qiáng)的結(jié)合能力，從而降低細(xì)胞內(nèi)重金屬的生物有效性，有效地降低了重金屬對(duì)細(xì)胞的毒性，從而增強(qiáng)了菌株對(duì)重金屬的抗性[7-8].本實(shí)驗(yàn)中，凡口鉛鋅礦常年受到Pb2+和Zn2+污染，由于環(huán)境選擇的壓力，菌株MS1細(xì)胞內(nèi)可能產(chǎn)生了較多的能與Zn2+和Pb2+結(jié)合生成無(wú)毒螯合物的蛋白質(zhì)，從而提高了對(duì)Zn2+和Pb2+的抗性.

本實(shí)驗(yàn)中， 菌株MS1對(duì)Zn2+和Pb2+都有一定的吸附作用，最大吸附量分別為20.0和13.9 mg/g，最大吸附率分別為25.2%和23.3%(圖4、圖5)，對(duì)Zn2+的吸附能力要強(qiáng)于Pb2+，這可用“吸附+細(xì)胞膜傳輸”模型來(lái)解釋[9-10].該模型認(rèn)為菌體對(duì)金屬的吸附分為直接結(jié)合在細(xì)胞表面的物理吸附過(guò)程和靠細(xì)胞代謝向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移運(yùn)送的生物學(xué)過(guò)程.Zn2+的毒性相對(duì)較小，且是一種生長(zhǎng)必須的微量元素，多數(shù)微生物都存在主動(dòng)吸收的機(jī)制.因此生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞除表面積累外，還將Zn2+離子轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，供菌體生長(zhǎng)代謝需要.由于Pb2+離子毒性較大，生長(zhǎng)的菌體可能沒(méi)有通過(guò)胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程，沒(méi)有對(duì)Pb2+離子進(jìn)行主動(dòng)吸收，所以環(huán)境中重金屬離子的減少可能主要是通過(guò)菌體細(xì)胞的表面積累.

4 結(jié)論

從廣東凡口鉛鋅礦分離到1株重金屬抗性細(xì)菌菌株MS1，菌株MS1對(duì)Pb2+和Zn2+的最大耐受濃度分別為4、40 mmol/L.當(dāng)Pb2+濃度低于3 mmol/L和Zn2+濃度低于30 mmol/L時(shí)，對(duì)菌株MS1生長(zhǎng)的影響不大.菌株MS1對(duì)Zn2+和Pb2+有較強(qiáng)吸附作用，其中對(duì)Zn2+的吸附能力大于對(duì)Pb2+的吸附能力.菌株MS1可用于重金屬污染水體的修復(fù).

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PbandZnResistanceandAdsorptionofBacterialStrainMS1

WU Fangmeng1， HE Huidong1， YAN Junlan1, YANG Danjing2， JING Yuanxiao1*
(1.Key Laboratory of Ecology and Environmental Science of Guangdong Higher Education, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2.Guangzhou Research Academy of Environmental Protection, Guangzhou 510620, China)

A heavy metal-resistance bacterial strain MS1 was isolated from the Fankou Pb-Zn mine tailings in Guangdong Province. The minimum inhibiting concentrations of Pb2+and Zn2+to the strain were 4 and 40 mmol/L, respectively. Strain MS1 could grow at temperatures 17-37 ℃, pH 3-13 and high salinity conditions, with optimal conditions of temperature 27 ℃, pH 7.0 and 5% salinity. The maximum adsorption quantities and the maximum adsorption rates of strain MS1 to Pb2+and Zn2+were 13.9, 20.0 mg/g and 23.3%, 25.2% at 2 mmol/L Pb2+and 10 mmol/L Zn2+within 60 h, respectively. The adsorption ability of strain MS1 to Zn2+was greater than Pb2+. In a word, strain MS1 had strong resistance and adsorption ability to Pb2+and Zn2+, and could be used to remediate heavy metal polluted water.

2012-01-03

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2005B33302014)

*通訊作者，jingyx@scnu.edu.cn

1000-5463(2012)03-0116-04

Q939

A

10.6054/j.jscnun.2012.06.025

Keywords： Zn2+; Pb2+; heavy metal resistance; bacterium; adsorption

【責(zé)任編輯 成 文】