范博強(qiáng)，侯國(guó)強(qiáng)，潘 璇，李東風(fēng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510631)

成年斑胸草雀弓狀皮質(zhì)櫟核投射神經(jīng)元電生理特性的性別差異

范博強(qiáng)，侯國(guó)強(qiáng)，潘 璇，李東風(fēng)*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510631)

利用離體腦片膜片鉗技術(shù)檢測(cè)RA投射神經(jīng)元電生理活動(dòng)的主動(dòng)和被動(dòng)特性，對(duì)其性別差異進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)鳴禽RA投射神經(jīng)元電生理特性在發(fā)放頻率和誘發(fā)動(dòng)作電位幅值方面存在明顯的性別差異.

成年斑胸草雀； 弓狀皮質(zhì)櫟核投射神經(jīng)元； 電生理特性； 性別差異

鳴禽是研究學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)機(jī)制的理想動(dòng)物模型.鳴禽的鳴唱學(xué)習(xí)依賴于腦內(nèi)的一組離散的核團(tuán)以及它們之間的連接通路，其被稱之為鳴唱控制系統(tǒng)[1].鳴唱控制系統(tǒng)由發(fā)聲運(yùn)動(dòng)通路和前端腦學(xué)習(xí)通路組成.其中發(fā)聲運(yùn)動(dòng)通路由高級(jí)發(fā)聲中樞(high vocal centre, HVC)直接發(fā)出投射神經(jīng)元與前運(yùn)動(dòng)核團(tuán)弓狀皮質(zhì)櫟核(robust nucleus of the arcopallium, RA)形成突觸連接.發(fā)聲運(yùn)動(dòng)通路的主要功能在于控制鳴曲的發(fā)出，直接參與鳴禽的發(fā)聲運(yùn)動(dòng)行為.而前端腦通路也是由HVC發(fā)出，最后通過新紋狀體前部巨細(xì)胞核外側(cè)部(lateral magnocellular nucleus of the anterior neostriatum, LMAN)將前端腦通路中的信息傳遞給RA.其主要功能是鳴曲的習(xí)得及對(duì)鳴唱可塑性的調(diào)節(jié)[2].RA作為運(yùn)動(dòng)指令信息輸出核團(tuán)，其核團(tuán)內(nèi)的生理活動(dòng)變化成為2條通路影響鳴唱的最直接作用靶點(diǎn).因此，RA核團(tuán)在鳴唱系統(tǒng)中占有重要的地位.RA核團(tuán)主要由2類神經(jīng)元組成：投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元，其電生理特性具有明顯的差異[3].

鳴禽的鳴唱有著明顯的性別差異.對(duì)鳴禽性別差異的研究多是從激素水平對(duì)鳴禽相關(guān)鳴唱核團(tuán)進(jìn)行研究，很少有從單個(gè)神經(jīng)元水平比較鳴禽性別差異的報(bào)道[4-5].鳴禽鳴唱系統(tǒng)在單個(gè)神經(jīng)元水平上是否存在與核團(tuán)水平類似的性別差異？單個(gè)神經(jīng)元的電生理特性是否存在性別差異？這些需要進(jìn)一步深入研究.本研究利用離體腦片膜片鉗技術(shù),對(duì)不同性別的斑胸草雀中RA核團(tuán)投射神經(jīng)元電生理特性進(jìn)行比較，觀察其在電生理特性方面的差異.

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的成年雌性和雄性斑胸草雀(Taeniopygiaguttata)各10只，體質(zhì)量10～15 g，由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物房提供.

1.2試劑

切片液(mmol/L)為：Sucrose 248，KCl 5，NaHCO328，Glucose 10，MgSO4·7H2O 1.3，NaH2PO4·H2O 1.26；人工腦脊液(mmol/L)為：NaCl 125，NaHCO325，NaH2PO4·H2O 1.27，KCl 2.5，MgSO4·7H2O 1.2，CaCl22.0，Glucose 25；用蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓至350 mOsm.電極內(nèi)液(mmol/L)為：KMeSO4120，NaCl 5，HEPES 10，EGTA 2，Mg-ATP 2，Na-GTP 0.3，pH 7.2，滲透壓330 mOsm.

1.3主要儀器

微電極拉制器(P-97, Sutter Instrument, USA)、振動(dòng)切片機(jī)(NVSIM1, WPI, USA)、正置顯微鏡(OLYMPUS, DP30BW, JAPAN)、微操縱器(MP-285, Sutter Instrument)、膜片鉗放大器(MultiClamp 700B, Axon Instrument)、數(shù)/模轉(zhuǎn)換器(DIGIDATA 1322A, Axon Instrument)、pClamp9.2軟件(Axon Instruments)等.

1.4腦片的制備

麻醉后快速斷頭，迅速取腦置于已預(yù)通15 min 95%O2+5%CO2混合氣(體積分?jǐn)?shù)，下同)的冰水混合的切片液中冷卻30 s～1 min，然后用振動(dòng)切片機(jī)切取含有RA核團(tuán)的腦片，約250～300 μm，轉(zhuǎn)移到37 ℃的孵育槽，通以95%O2+5%CO2混合氣，孵育30 min，然后在35 ℃人工腦脊液中孵育1 h，之后保持室溫孵育.在此條件下腦片可存活8～10 h，通氣時(shí)注意防止腦片隨氣泡翻動(dòng).

1.5膜片鉗全細(xì)胞式記錄

1.5.1 微電極的制備 硬質(zhì)玻璃毛坯管(Sutter Instrument)拉制微電極.在全細(xì)胞記錄中應(yīng)用的記錄電極尖端的阻抗一般為3～5 MΩ.

1.5.2 膜片鉗記錄 取孵育好的腦片放到記錄槽內(nèi)并將腦片輕輕壓住，在顯微鏡下尋找合適的RA投射神經(jīng)元[6].先封接形成細(xì)胞吸附式，然后在電壓鉗模式下破膜為全細(xì)胞式.分別在2種模式下記錄RA投射神經(jīng)元的自發(fā)與誘發(fā)電位.每個(gè)細(xì)胞記錄時(shí)間大約為15～20 min.

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)記錄到的信號(hào)輸入膜片鉗放大器，并由數(shù)模轉(zhuǎn)換器最終轉(zhuǎn)入相連的計(jì)算機(jī)，記錄信號(hào)的監(jiān)測(cè)、存儲(chǔ)及分析處理以及通過記錄電極給予細(xì)胞的指令電壓均由pClamp 9.2軟件完成.所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)由Origin 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖.數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1RA核團(tuán)及其神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察

在低倍顯微鏡下(5×)，雄鳥RA核團(tuán)呈卵圓形，輪廓清晰，與周圍組織界限明顯.雌鳥RA核團(tuán)外形與雄鳥類似，輪廓界限較雄鳥略模糊.在高倍鏡下(40×)，可明顯觀察到密集交錯(cuò)的神經(jīng)纖維和微細(xì)血管.

2.2吸附式記錄模式下RA核團(tuán)單個(gè)投射神經(jīng)元自發(fā)放頻率

在吸附式膜片鉗記錄模式下比較了RA核團(tuán)投

射神經(jīng)元自發(fā)放頻率的性別差異(圖1).雌鳥RA投射神經(jīng)元的平均發(fā)放頻率為(6.53±1.53)Hz(n=20)，雄鳥RA投射神經(jīng)元的平均發(fā)放頻率為(11.63±0.32)Hz(n=27)，雄鳥RA投射神經(jīng)元自發(fā)放頻率明顯大于雌鳥(P<0.01).

圖1 成年雌雄斑胸草雀RA投射神經(jīng)元自發(fā)放頻率

Figure 1 The spontaneous firing rates of RA projection neurons in female and male zebra finches

2.3向RA投射神經(jīng)元注入去極化電流引起動(dòng)作電位發(fā)放頻率的變化

在全細(xì)胞電流鉗模式下，以神經(jīng)元的靜息電位為基礎(chǔ)給予去極化階躍電流刺激，根據(jù)去極化電流誘導(dǎo)的穩(wěn)定反應(yīng)，繪制隨注入電流增加而誘發(fā)動(dòng)作電位頻率增加的F-I曲線圖.比較雌鳥和雄鳥F-I曲線斜率，可以看出給予不同的去極化電流刺激，隨著注入電流的增加，雄鳥RA投射神經(jīng)元所誘發(fā)出動(dòng)作電位的頻率均明顯高于雌鳥(圖2).圖2A和2C中雌鳥F-I曲線的斜率為(63.26±3.41)Hz/nA，雄鳥F-I曲線的斜率為(117.1± 1.04)Hz/nA.雄鳥F-I曲線的斜率顯著大于雌鳥(P<0.05).圖2B和2D中雌鳥F-I曲線的斜率為(75.95±7.16)Hz/nA，雄鳥F-I曲線的斜率為(122.52±5.91)Hz/nA.雄鳥F-I曲線的斜率顯著大于雌鳥(P<0.05).

2.4向RA投射神經(jīng)元注入去極化電流激發(fā)動(dòng)作電位幅值的變化

對(duì)RA投射神經(jīng)元分別注入不同強(qiáng)度的去極化電流，比較隨去極化電流注入誘發(fā)RA投射神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环档淖兓?對(duì)于不同強(qiáng)度的去極化電流，雄鳥RA神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆当３窒鄬?duì)恒定，而雌鳥RA神經(jīng)元對(duì)于強(qiáng)度過大的電流其動(dòng)作電位的幅值會(huì)明顯降低.而在不同強(qiáng)度去極化電流注入的情況下，雌鳥RA神經(jīng)元所誘發(fā)動(dòng)作電位的幅值均要顯著大于雄鳥(圖3).

注：(A)，(C)：給予RA神經(jīng)元去極化電流刺激，起始強(qiáng)度0 pA,脈沖時(shí)間1 600 ms，躍階為200 pA,，連續(xù)4個(gè)刺激；(B)，(D)：給予RA神經(jīng)元去極化電流刺激，起始強(qiáng)度0 pA,脈沖時(shí)間1 000 ms，躍階為100 pA,連續(xù)9個(gè)刺激

圖2 注入電流時(shí)成年雌雄斑胸草雀RA投射神經(jīng)元發(fā)放頻率

Figure 2 The firing frequency-injected current relationship of RA projection neurons between female and male zebra finches

注：(A)，(C)：給予RA神經(jīng)元去極化電流刺激，起始強(qiáng)度0 pA,脈沖時(shí)間1 600 ms，躍階為200 pA,連續(xù)4個(gè)刺激；(B)，(D)：給予RA神經(jīng)元去極化電流刺激，起始強(qiáng)度0 pA,脈沖時(shí)間1 000 ms，躍階為100 pA,連續(xù)9個(gè)刺激.

圖3 注入電流時(shí)雌雄成年斑胸草雀RA投射神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环?/p>

Figure 3 The peak amplitude -injected current relationship of RA projection neurons between female and male zebra finches

3 討論

3.1RA核團(tuán)形態(tài)學(xué)的性別差異

鳴禽的鳴唱控制核團(tuán)具有明顯的性二態(tài)性，雄鳥的HVC,RA核團(tuán)體積要明顯大于雌鳥[5].雄鳥RA核團(tuán)內(nèi)神經(jīng)元分布更稀疏，每一個(gè)神經(jīng)元占據(jù)相對(duì)更大的位置，擁有著更多的突觸連接，表明雄鳥RA神經(jīng)元執(zhí)行著更復(fù)雜的功能.這些結(jié)果提示，鳴禽鳴唱系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的性二態(tài)性與鳴禽鳴唱能力的性別差異具有很大關(guān)聯(lián).

3.2RA投射神經(jīng)元自發(fā)放頻率的性別差異

MEITZEN等[7]發(fā)現(xiàn)改變成年白冠雀光周期和體內(nèi)睪酮的水平，RA投射神經(jīng)元的電生理特性會(huì)發(fā)生改變.長(zhǎng)日照會(huì)提高雄鳥體內(nèi)睪酮水平，其RA投射神經(jīng)元的胞體會(huì)增大，自發(fā)放頻率，膜時(shí)間常數(shù)和膜電容都會(huì)上升.性激素影響神經(jīng)元興奮性在其他動(dòng)物也有發(fā)現(xiàn)，雄珍蟾魚的發(fā)聲要遠(yuǎn)多于雌魚，其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)放頻率也要高于雌魚[8].LIU等[6]應(yīng)用吸附式膜片鉗技術(shù)證明成年斑胸草雀RA神經(jīng)元自發(fā)放頻率也具有明顯的性別二態(tài)性，雄鳥RA神經(jīng)元自發(fā)放頻率明顯高于雌鳥.雄鳥的鳴唱能力顯著高于雌鳥，提示自發(fā)放頻率的增加導(dǎo)致產(chǎn)生更多的動(dòng)作電位，使神經(jīng)元更好地響應(yīng)突觸輸入.造成雌雄RA單個(gè)神經(jīng)元自發(fā)放活動(dòng)差異的原因可能與雌雄鳴禽體內(nèi)及相關(guān)腦區(qū)內(nèi)激素水平有關(guān).

3.3注入電流引起RA投射神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率的性別差異

在細(xì)胞吸附式記錄的基礎(chǔ)上進(jìn)一步破膜形成全細(xì)胞記錄.全細(xì)胞記錄可以獲得整個(gè)細(xì)胞的功能變化信息.本實(shí)驗(yàn)中雄鳥RA投射神經(jīng)元在吸附式電壓鉗和全細(xì)胞式電流鉗下，均表現(xiàn)出穩(wěn)定的自發(fā)放.而雌鳥只在吸附式電壓鉗下表現(xiàn)出較穩(wěn)定的自發(fā)放，當(dāng)形成全細(xì)胞式之后在電流鉗下幾乎記錄不到自發(fā)放，表明雄鳥RA投射神經(jīng)元的自發(fā)放比雌鳥更穩(wěn)定和持久.

對(duì)RA投射神經(jīng)元分別注入不同強(qiáng)度的去極化電流，均可以誘導(dǎo)出穩(wěn)定的動(dòng)作電位.將注入去極化電流期間動(dòng)作電位發(fā)放的平均頻率與注入電流強(qiáng)度作圖，得到F-I曲線，該曲線反應(yīng)了神經(jīng)元對(duì)輸入信號(hào)的反應(yīng).結(jié)果表明，無(wú)論注入強(qiáng)度較大或較小的去極化電流，雄鳥F-I曲線斜率都明顯大于雌鳥，同時(shí)注入同樣電流所誘發(fā)的動(dòng)作電位頻率，雄鳥也是顯著高于雌鳥，說明雄鳥RA投射神經(jīng)元對(duì)于電流刺激能引起更高頻率的動(dòng)作電位發(fā)放.

綜上所述，無(wú)論是自發(fā)放還是注入去極化電流誘發(fā)動(dòng)作電位，雄鳥RA投射神經(jīng)元的發(fā)放頻率均顯著高于雌鳥，這一結(jié)果與雄鳥更善于鳴唱的行為相對(duì)應(yīng).造成這一現(xiàn)象的原因可能和鳴禽體內(nèi)激素水平有關(guān).

3.4注入電流引起RA投射神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环档男詣e差異

對(duì)RA投射神經(jīng)元分別注入去極化電流，均誘導(dǎo)出穩(wěn)定的動(dòng)作電位.對(duì)于不同強(qiáng)度的去極化電流，雄鳥動(dòng)作電位的幅值保持相對(duì)恒定，而雌鳥對(duì)于強(qiáng)度過大的電流，其動(dòng)作電位的幅值會(huì)明顯降低.表明雄鳥RA投射神經(jīng)元可以承受更大強(qiáng)度的電流刺激，這與雄鳥更擅長(zhǎng)鳴唱的行為對(duì)應(yīng)，提示雄鳥RA投射神經(jīng)元可以接受更強(qiáng)的突觸輸入[6].比較注入電流誘發(fā)動(dòng)作電位幅值可以發(fā)現(xiàn)存在明顯的性別差異，雌鳥RA投射神經(jīng)元誘發(fā)出動(dòng)作電位的幅值明顯高于雄鳥,即使在受到強(qiáng)度過大電流刺激而導(dǎo)致動(dòng)作電位幅值下降時(shí)也要高于雄鳥,提示成年斑胸草雀RA投射神經(jīng)元電生理特性在多個(gè)指標(biāo)存在性別差異.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明了成年斑胸草雀RA不僅在核團(tuán)形態(tài)上存在明顯的性別差異，在單個(gè)神經(jīng)元水平自發(fā)放和誘發(fā)放頻率，動(dòng)作電位幅值等指標(biāo)上也存在明顯的性別差異.造成這些差異的原因可能和鳴禽體內(nèi)激素水平有關(guān)，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究.

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Keywords： adult zebra finch; projection neuron of robust nucleus of the arcopallium (RA); electrophysiological properties; sexual dimorphism

SexualDimorphismoftheElectrophysiologicalPropertiesofProjectionNeuronsintheRobustNucleusoftheArcopalliuminAdultZebraFinches(Taeniopygiaguttata)

FAN Boqiang, HOU Guoqiang， PAN Xuan, LI Dongfeng*

(School of Life Science, South China Normal University， Guangzhou 510631， China)

Songbird is an ideal animal model for studying the mechanism of learning and memory of languages. The song system of zebra finches is highly sexually different. Uncover the mechanism underlying sexual-difference is important for the neural basis of birdsong. The role of single neuron on sexual-difference is rarely reported. Our current studies focus on RA single projection neurons. The active and passive electrophysiological properties were examined by cell attached patch or whole-cell patch recordings. We report here that the firing rate and peak amplitude of action potential in RA projection neurons in adult zebra finches are sexual dimorphism.

2011-06-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970363;31172092)

*通訊作者, dfliswx@126.com

1000-5463(2012)01-0109-04

Q424

A

【責(zé)任編輯 成 文】