趙麗波 張健莉 付宏娟 黃月萍

黑龍江省醫(yī)院老年神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150036

他克莫司對(duì)多發(fā)性硬化大鼠髓鞘堿性蛋白的動(dòng)態(tài)變化及影響

趙麗波 張健莉 付宏娟 黃月萍

黑龍江省醫(yī)院老年神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150036

目的 探討他克莫司（FK506）對(duì)多發(fā)性硬化（MS）大鼠髓鞘堿性蛋白檢測(cè)的動(dòng)態(tài)變化及影響。 方法 將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組（10只）予以實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）+生理鹽水組；研究組（12只）在EAE誘導(dǎo)的第1～7天，每日腹腔內(nèi)注射劑量為1mg/kg的FK506，其中急性發(fā)作期8只，緩解期4只。檢測(cè)研究組和對(duì)照組周圍血和腦脊液髓鞘堿性蛋白（MBP）的水平，并動(dòng)態(tài)觀察應(yīng)用他克莫司治療前及治療后不同時(shí)間MBP的變化情況。結(jié)果 研究組血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。且兩組腦脊液中的MBP水平均顯著高于血清中MBP水平（P＜0.05）。研究組大鼠急性發(fā)作期及緩解期血清及腦脊液中MBP水平分別明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），且大鼠急性發(fā)作期MBP水平血清及腦脊液中均分別顯著高于MS緩解期（P＜0.01）。且大鼠腦脊液MBP和血清MBP水平呈正相關(guān)（r=0.562，P＜0.01）。12只大鼠予以他克莫司腹腔注射后，治療后的第3天及治療后第7天血清和腦脊液MBP水平均較治療前明顯降低，且腦脊液MBP水平較血清MBP水平降低更明顯（P＜0.01）。 結(jié)論 通過檢測(cè)周圍血和MBP的水平，并動(dòng)態(tài)觀察應(yīng)用他克莫司治療前及治療后MBP的變化情況，一方面對(duì)判斷MS預(yù)后、病情嚴(yán)重程度和臨床診斷具有重要的臨床意義，另一方面可能為預(yù)防多發(fā)性硬化的臨床復(fù)發(fā)提供一種有效的新藥提供指導(dǎo)依據(jù)。

多發(fā)性硬化；髓鞘堿性蛋白；血液；腦脊液；大鼠

多發(fā)性硬化（mulitple sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點(diǎn)的自身免疫性疾病，MS產(chǎn)生的免疫反應(yīng)多認(rèn)為是自身免疫細(xì)胞被激活后對(duì)髓鞘堿性蛋白（MBP）的免疫反應(yīng)[1]。MBP是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的一種特殊蛋白質(zhì)，在髓鞘形成和腦分化發(fā)育過程中起著重要作用[2]。MS患者體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身抗原-MBP暴露與免疫活性細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)了特異的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎性髓鞘病理性脫失，游離的MBP就會(huì)進(jìn)入血液中導(dǎo)致血液中含量升高[3]。目前臨床對(duì)MS進(jìn)行腦脊液免疫學(xué)檢查項(xiàng)目較多，但尚無一滿意的特異性檢查，因此，臨床一般將周圍血和腦脊液同時(shí)進(jìn)行檢查[4]。他克莫司（FK506）是一種免疫抑制劑，除了在抑制器官移植排斥反應(yīng)方面具有顯著療效外，還廣泛應(yīng)用于斑禿、銀屑病、魚鱗病、糖尿病、白塞病、變應(yīng)性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及多發(fā)性硬化病等自身免疫疾病的治療，在對(duì)脊髓損傷的模型中具有保護(hù)神經(jīng)，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和促進(jìn)神經(jīng)再生和抑制T細(xì)胞增生、活化的作用。本研究旨在通過觀察利用髓鞘堿性蛋白作為抗原，復(fù)制MS的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）豚鼠周圍血和腦脊液MBP的水平，并動(dòng)態(tài)觀察應(yīng)用他克莫司治療前及治療后不同時(shí)間MBP的變化情況，從而可能為預(yù)防MS的臨床復(fù)發(fā)提供一種有效的新藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法

豚鼠22只，雌雄各半，7～8周齡，體重 200 g左右，利用髓鞘堿性蛋白作為抗原，復(fù)制MS的動(dòng)物模型EAE，在每只大鼠的雙側(cè)后足跖一次性皮下注射含有豚鼠MBP 25μg的弗氏完全佐劑（FCA）200μL，模型制備成功的表現(xiàn)為急性、嚴(yán)重的單向病程，可自發(fā)緩解。將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組予以EAE+生理鹽水，共10只，研究組在EAE誘導(dǎo)的第1～7天，每日腹腔內(nèi)注射劑量為1mg/kg的FK506，共12只，其中急性發(fā)作期8只，緩解期4只。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠及對(duì)照組血清和腦脊液中MBP水平比較

研究組大鼠血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且兩組腦脊液中的MBP水平均顯著高于血清中MBP水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 1。

表1 兩組大鼠血清和腦脊液中MBP水平比較（，ng/m L）

表1 兩組大鼠血清和腦脊液中MBP水平比較（，ng/m L）

注：與同組血清MBP比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) MBP水平血清 腦脊液研究組對(duì)照組12 10 t值 P值7.62±1.74 1.52±0.83 3.946＜0.01 12.07±3.42#4.39±1.35#5.284＜0.01

2.2 大鼠急性發(fā)作期及緩解期MBP在血清及腦脊液中的變化情況比較

研究組MS大鼠急性發(fā)作期及緩解期血清及腦脊液中MBP水平分別明顯高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且MS急性發(fā)作期MBP水平血清及腦脊液中均分別顯著高于MS緩解期，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且MS大鼠其腦脊液MBP和血清MBP水平呈正相關(guān) （r=0.562，P ＜ 0.01）。 見表 2。

2.3 研究組大鼠血清和腦脊液治療前后不同時(shí)間MBP水平的變化情況比較

12只大鼠予以他克莫司注射后，結(jié)果顯示，治療后的第3天及治療后第7天血清和腦脊液MBP水平均較治療前明顯降低（P＜0.01），且腦脊液MBP水平較血清MBP水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

3 討論

MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，其病因及病理學(xué)機(jī)制至今仍未完全闡明，但MS自身免疫的發(fā)病機(jī)制已得到證實(shí)和公認(rèn)[5]。各種原因?qū)е滤枨势茐暮?，血清或腦脊液中的MBP濃度增高，因此測(cè)定血清和腦脊液MBP的水平，可以用于反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)有無實(shí)質(zhì)性損害及有無髓鞘脫失[6]。由于MS患者的免疫功能異常，使MBP具有抗原性，引起T淋巴細(xì)胞致敏活化，而致敏的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)對(duì)髓鞘有很大的破壞作用[7]。

表2 大鼠急性發(fā)作期及緩解期MBP在血清及腦脊液中的變化情況比較（，ng/m L）

表2 大鼠急性發(fā)作期及緩解期MBP在血清及腦脊液中的變化情況比較（，ng/m L）

注：與緩解期比較，*P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.01

組別 只數(shù) MBP水平血清 腦脊液急性發(fā)作期緩解期對(duì)照組F值P值8 4 1 0 10.86±1.59*△5.35±1.14△1.52±0.83 5.342＜0.01 17.45±2.82*△8.23±1.44△4.39±1.35 7.231＜0.01

表3 研究組大鼠血清和腦脊液治療前及治療后的不同時(shí)間MBP 的變化情況比較（，ng/m L，n=32）

表3 研究組大鼠血清和腦脊液治療前及治療后的不同時(shí)間MBP 的變化情況比較（，ng/m L，n=32）

指標(biāo) 治療前 治療后第3天治療后第7天 F值 P值血清MBP水平腦脊液MBP水平t值P值8.29±1.31 12.07±3.42 3.389＜0.01 7.62±1.74 5.84±1.85 3.971＜0.01 3.89±0.42 1.67±0.23 0.428＜0.01 8.253 9.527＜0.01＜0.01

本組資料顯示，研究組大鼠血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），提示檢測(cè)MBP含量變化是診斷MS的一項(xiàng)有價(jià)值的生化指標(biāo)，本組表2結(jié)果顯示，研究組急性發(fā)作期及緩解期大鼠血清及腦脊液中MBP水平分別明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），說明大鼠活動(dòng)期血清MBP明顯升高，反映了損害的范圍和嚴(yán)重程度，尤其對(duì)判斷MS是否處于活動(dòng)期具有重要的臨床意義[8]。

本組表1、2均顯示，研究組12只大鼠，其中急性發(fā)作期8只MS其腦脊液中MBP水平最高。Majewska等[9-10]研究證實(shí)，MS患者急性期腦脊液MBP與臨床評(píng)分關(guān)系密切，提出監(jiān)測(cè)腦脊液MBP的變化水平，有利于判斷MS的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。且大鼠腦脊液MBP和血清MBP水平呈正相關(guān)（r=0.562，P＜0.01），說明作為主要自身抗原之一的MBP對(duì)MS的發(fā)病敏感性高，檢測(cè)患者CSF和血清中的MBP水平對(duì)于MS的診斷和療效監(jiān)測(cè)有重要參考價(jià)值。

FK506是一種新型免疫抑制劑，是一種廣泛應(yīng)用于器官移植的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制藥物，于1984年從日本筑波山土壤中被分離到。研究組12只大鼠應(yīng)用他克莫司治療后，MBP水平在治療前明顯增加，但治療后的第3天及治療后的第7天的不同時(shí)間顯著下降，說明MS對(duì)他克莫司等激索類藥物的短程療效較好。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者將FK506應(yīng)用于自身免疫性疾病的研究，其中，Gold等[11]研究證實(shí)，F(xiàn)K506通過免疫抑制和神經(jīng)保護(hù)作用顯著改善小鼠的髓鞘脫失和軸突損傷。

綜上所述，通過檢測(cè)周圍血和腦脊液髓鞘堿性蛋白的水平，并動(dòng)態(tài)觀察應(yīng)用他克莫司治療前及治療后MBP的變化情況，一方面對(duì)判斷MS預(yù)后、病情嚴(yán)重程度和臨床診斷具有重要的臨床意義，另一方面可能為預(yù)防多發(fā)性硬化的臨床復(fù)發(fā)提供一種有效的新藥提供指導(dǎo)依據(jù)，但由于樣本量過小，仍需日后在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)一步深入研究。

[1]O'Connor KC，Chitnis T，Griffin DE，et al.Myelin basic protein-reactive antoantibodies in the serum and cerebrospinal fluid ofmultiple sclerosis patients are characterized by low-affinity interactions [J].JNeuroimmunol，2003，136（2）：140-148.

[2]董亞賢，梁永源，林佩玉，等.MBP，TNF-α在格林-巴利綜合征與多發(fā)性硬化發(fā)病機(jī)制中的作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2008，29（3）：436-437.

[3]趙薛旭，田作軍，李作漢，等.多發(fā)性硬化患者腦脊液和血清中髓鞘堿蛋白和白介素-16 的相關(guān)研究[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2003，16（4）：205-207.

[4]姜紅彥，王蘇平，李宏元.多發(fā)性硬化患者血清IL-17水平和髓鞘堿性蛋白相關(guān)性的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（2）：179-180.

[5]趙萍.腦脊液免疫學(xué)檢查對(duì)多發(fā)性硬化的診斷價(jià)值[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2007，20（6）：621-622.

[6]田作軍，趙薛旭，李作漢，等.髓鞘堿性蛋白和白細(xì)胞介素16在多發(fā)性硬化發(fā)病機(jī)制和臨床中的探討[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2006，6（8）：883-884.

[7]Chamczuk AJ，Ursell M，O'Connor P，et al.A rapid ELISA-based serum assay formyelin basic protein inmultiple sclerosis[J].J Immunol Methods，2002，262（1-2）：21-27.

[8]董亞賢，庾竹筠，林佩玉，等.髓鞘堿性蛋白和腫瘤壞死因子儀水平與Guillain-BaⅡe綜合征和多發(fā)性硬化的關(guān)系[J].中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志， 2007，13（4）：250-251.

[9]MajewskaM，Zajac K，SrebroZ，etal．Epicutaneousimmunizationwithmyelin basic protein protects from the experimentalautoimmune encephalomyelitis[J].Pharmacol Rep，2007，59（1）：74-79.

[10]田作軍，趙薛旭，李作漢，等.應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)髓鞘堿性蛋白對(duì)多發(fā)性硬化的診斷價(jià)值[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（2）：250-251.

[11]Gold BG，Voda J，Yu X，etal.FK506andanonimmunosuppressantderivative reduce axonal and myelin damage in experimental autoimmune encephalomyelitis：neuroimmunophilin ligand-mediatedneuroprotection in amodelofmultiple sclerosis[J].JNeurosciRes，2004，77（3）：367-377.

Influence of FK 506 on dynam ic change of m yelin basic protein in rats with multiple sclerosis

ZHAO Libo ZHANG Jianli FU Hongjuan HUANG Yueping
Department of Old Age Neurology,Heilongjiang Province Hospital,Heilongjiang Province,Harbin 150036,China

Objective To explore the impact of the dynamic changes of tacrolimus formultiple sclerosis ratmyelin basic protein detection.MethodsExperimental animalswere randomly divided into two groups,the control group were given the EAE+saline group,a total 10,study group in EAE induced daily intraperitoneal injection dose for 1mg/kg FK506 from 1 to 7 days,a total of 12 acute exacerbation of 8 rats,4 rats in remission.We examined the level of the blood and cerebrospinal fluidmyelin basic protein(MBP)and dynamic observation for12 casesMSrats(study group)and 10 normalhealthy subjects(control group).ResultsMBP(research group)in serum and cerebrospinal fluid were significantly higher than that of the normal control group(P<0.05).And MBP in the cerebrospinal fluid of two groupswere significantly higher than the serum MBP level(P<0.05).The serum and CSFMBP level of acute exacerbation and remission period of MS rats in the research group were significantly higher than that in the control group (P<0.01),and MBP in serum and cerebrospinal fluid of acute exacerbation MSwere respectively significantly higher than MS rats in remission (P<0.01).In addition to the conventional basis for symptomatic 12 MS rates after admission tacrolimus treatment,after treatment 3 days and 7days,MBP level in the serum and CSF was significantly lower than before treatment,compared with serum，MBP levels in the cerebrospinal significantly decreased (P<0.01).ConclusionDynamic observation MBP the change by detecting the level of peripheral blood and MBP and the application of tacrolimus the secretary before treatmentand after treatment on the one hand,to judge MSprognosis,the severity of the disease and the clinical diagnosis has importantthe clinical significance,on the other hand,itmay be an effective new drug for the prevention ofmultiple sclerosis clinical recurrence provide the basis for guiding.

Multiple sclerosis;Myelin basic protein;Blood;Cerebrospinal fluid;Rats

R744.5

A

1673-7210（2012）12（a）-0016-03

黑龍江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（課題編號(hào)：GC12C305-1）。

2012-09-17 本文編輯：馮 婕）