陳扣寶 王 瑋

（巢湖市食品藥品監(jiān)督檢驗所，安徽 巢湖 238000）

氨溴特羅口服溶液具有止咳祛痰的新藥，其主要成分為鹽酸氨溴索和鹽酸克侖特羅。根據(jù)《中國藥典》2010年版的規(guī)定，藥品在進行微生物限度檢查前必須對其檢查方法進行驗證，以確認供試品所采用的檢查方法無抑菌作用后再進行檢查，才能真實反映供試品受污染的程度。因此，我們對氨溴特羅口服溶液進行了微生物限度檢查的方法驗證。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

凈化工作臺、托盤天平、HTY-761勻漿儀、HTY-ⅢA集菌儀（杭州高德泰林有限公司）、開放式薄膜過濾器（杭州高德泰林有限公司）、BIO-Ⅱ-A2生物安全柜（上海振梓空氣凈化設備有限公司）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械一廠）、YQL-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器、MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養(yǎng)基等均由中國藥品生物制品檢定所提供。稀釋劑：pH 7.0蛋白胨-氯化鈉緩沖液（稀釋供試品用，中國藥品生物制品檢定所提供），靛基質(zhì)試液由本實驗室提供。

1.3 供試品

氨溴特羅口服溶液（規(guī)格：100mL/瓶，生產(chǎn)廠家：市售，批號：101126、101127、101128）

1.4 試驗菌

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法和結果

按中國藥典2010年版二部附錄Ⅺ J有關微生物檢查方法驗證試驗[1,2]。

2.1 菌液的制備

2.2 供試液制備

取10mL供試品，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，用勻漿儀（2000r/min，2min）混勻，作為1:10倍的供試液備用。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.3.1 試驗組

取1:10倍供試液1mL和1mL已制備好的菌液，注入同一平皿，迅速倒入15～20mL 45℃的相應瓊脂培養(yǎng)基，待凝，每個菌株制備2個平皿。細菌在30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h～72h；霉菌在23～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～120h，逐日觀察，點計菌落數(shù)，取均值。

2.3.2 菌液組

分別取菌液1mL注入平皿內(nèi)，每種菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數(shù)。

2.3.3 供試品對照組

按試驗組方法，不加菌液，測定供試品菌數(shù)（本底菌）。

2.3.4 稀釋劑對照組

取與供試液等量的稀釋劑和菌懸液各1mL注入一個平皿中，平行做2份，培養(yǎng)基注皿，培養(yǎng)，計數(shù)，取均值。

2.3.5 回收率測定

按下列公式：

（以下同）計算回收率，

（以下同）計算回收率，

常規(guī)法的回收率結果見表1。

從表1結果看，采用常規(guī)法檢查供試品，5種菌株的回收率均大于70%，因此可以采用常規(guī)法對該藥品細菌、霉菌和酵母菌進行計數(shù)檢查。

表1 常規(guī)法的回收率試驗結果（%）

2.4 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法的驗證

2.4.1 供試液的制備

同“2.2”項下1∶10供試液的制備。

2.4.2 試驗組

①常規(guī)法：取1:10的供試液10mL和大腸埃希菌懸液1mL（約為50～100cfu/mL）接種至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置于35℃培養(yǎng)18～24h，取0.2mL接種至5mLMUG培養(yǎng)基管內(nèi)，35℃培養(yǎng)，分別于5h與24h的時間，置366nm紫外光下觀察熒光，再沿培養(yǎng)管管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察結果。 同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。 ②培養(yǎng)基稀釋法 取1:10的供試液10mL和大腸埃希菌懸液1mL（約為50～100cfu/mL）接種至400mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置于35℃培養(yǎng)18～24h，取0.2mL接種至5mLMUG培養(yǎng)基管內(nèi)，35℃培養(yǎng)，分別于5h與24h的時間，置366nm紫外光下觀察熒光，再沿培養(yǎng)管管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察結果。同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。③薄膜過濾法 取1∶10的供試液10mL加入到已滅菌的反復使用全封閉薄膜過濾器中，過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液400mL沖洗（100mL/次，沖洗4次），在最后一次沖洗液中加入大腸埃希菌懸液1mL（約為50～100cfu/mL），取出濾膜接種至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置于35℃培養(yǎng)18～24h，取0.2mL接種至5mLMUG培養(yǎng)基管內(nèi)，35℃培養(yǎng)，分別于5h與24h的時間，置366nm紫外光下觀察熒光，再沿培養(yǎng)管管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察結果。同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。

2.4.3 陰性對照

取稀釋劑10mL取代供試液，其余照試驗組操作。

2.4.4 陽性對照

不加供試液，其余照試驗組操作。

2.4.5 供試品組

取供試液10mL，不加菌，其余照試驗組操作。

2.4.6 結果見表2。

表2 大腸埃希菌控制菌驗證方法試驗結果

從表2結果看，采用薄膜過濾法，陰性對照、供試品組未檢出試驗菌，陽性對照檢出試驗菌，試驗組檢出試驗菌，說明可采用薄膜過濾法（400mL沖洗，100mL/次）對該供試品進行控制菌檢查。

3 討 論

3.1 試驗結果表明，氨溴特羅口服溶液可采用平皿法進行細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)檢查，控制菌（大腸埃希菌）可采用薄膜過濾法（400mL沖洗，100mL/次）進行檢查。

3.2 在該驗證方案中有值得我們思考和研究之處

在細菌計數(shù)方法驗證時，我們針對大腸埃希菌的回收率的3次獨立試驗中，回收率均高于90%，表明該藥物對大腸埃希菌是沒有抑菌作用。但是，在控制菌（大腸埃希菌）檢查驗證試驗中，當我們采取常規(guī)法試驗時，試驗組在規(guī)定條件培養(yǎng)后，產(chǎn)酸產(chǎn)氣不明顯，MUG熒光與陽性對照比較時較弱，靛基質(zhì)試驗中變色不明顯；我們又用了培養(yǎng)基稀釋法，結果同常規(guī)法基本一致；最后通過驗證，我們采取薄膜過濾法（400mL沖洗，100mL/次）進行檢查，結果符合要求。從控制菌驗證試驗我們看出該藥物對大腸埃希菌是有抑制作用的，從這個角度分析，這與細菌驗證時的作用是相互矛盾。我們分析其原因：兩種試驗中唯一的區(qū)別在于培養(yǎng)基的差異，細菌計數(shù)采用營養(yǎng)瓊脂、控制菌檢查采用的是膽鹽乳糖液體培養(yǎng)基，因此我們認為培養(yǎng)基可能對藥物的菌落加樣回收具有不可消除作用。因此，我們在做微生物限度驗證試驗時應更加仔細，認真考慮所有的影響因素，勤比較、細觀察、多總結。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典二部[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄107.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范.2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:40-389.