★ 萬睿 辜尊濤 羅小泉 (江西中醫(yī)學(xué)院 南昌330004)

血管性癡呆(VD)是由于腦血管疾病和心血管疾病的原因，因缺血性、缺血性組織缺氧和出血性腦損害所導(dǎo)致的認(rèn)識喪失的一種慢性、進(jìn)行性、持續(xù)性智能障礙綜合征，是老年癡呆最常見的類型之一［1］。VD不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。鑒于目前對其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，且缺乏有效的防治措施。西醫(yī)對VD的治療目前沒有特殊的治療方法，也沒有特效藥物，主要針對危險因素(如控制高血壓、抗凝治療、抗血栓治療、控制膽固醇水平等);或采用膽堿酯酶抑制劑(如他克林、加蘭他敏、多奈哌齊等用于VD的治療)和改善腦循環(huán)藥物(如雙輕麥角堿等)，但效果均不理想。中醫(yī)藥治療VD能改善癥狀和緩解病程進(jìn)展，對智力的改善是不爭的事實，它的近期療效與同類西藥接近或優(yōu)于西藥，遠(yuǎn)期療效更好。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為VD的主要原因是脈絡(luò)瘀滯，腦失濡養(yǎng)，是一本虛標(biāo)實的疾患。據(jù)此我們在灌胃脂肪乳升高動物血脂的基礎(chǔ)上進(jìn)行手術(shù)，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，使腦組織尤其是海馬和大腦皮層產(chǎn)生缺血性損害，導(dǎo)致動物智力下降而產(chǎn)生癡呆。本文擬從大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織AchE及MDA含量進(jìn)行比較，旨在建立既符合VD癥狀又有中醫(yī)虛痰瘀證候表現(xiàn)的動物模型，為中醫(yī)藥探討該病的發(fā)病機(jī)制和治療打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 主要儀器和試劑 UV-1600型分光光度計(北京瑞利公司);Morris水迷宮硬件與視頻分析系統(tǒng)(北京天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司);AchE、MDA試劑盒(均購于江蘇省南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體重(180±20)g，由湖南斯萊克實驗動物有限公司提供(許可證號:SCXK(湘)2009-0004);動物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后采用Morris水迷宮定位航行進(jìn)行篩選，淘汰學(xué)習(xí)記憶能力差的大鼠，將合格的動物采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成正常假手術(shù)組、單純腦缺血再灌注模型組、高脂+腦缺血再灌注模型組。高脂組每天上午8:00及下午18:00用高脂乳劑按10 ml/kg·d灌胃，非高脂組按同樣劑量灌胃純凈水，連續(xù)灌胃15天，高脂組待血脂升高后方可進(jìn)行造模。

1.3 高脂乳劑的配制 按膽固醇10 g、豬油20 g、膽酸鈉2 g、甲基硫氧嘧啶1 g、吐溫－80 20 ml、丙二醇30 ml，蒸餾水加至100 ml的比例配制。先將豬油加熱熔化，后加入膽固醇溶化，再加入膽酸鈉和甲基硫氧嘧啶，充分?jǐn)噭?，最后放入吐溫?0、丙二醇和蒸餾水，不斷攪拌待全溶后冷卻至室溫，放入4℃的冰箱保存。用時加溫只37℃。

2 方法

2.1 建立模型

造模兩組動物稱重標(biāo)記后按3.5 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，常規(guī)固定消毒，小心游離雙側(cè)頸總動脈(CCA)備用。兩模型組夾閉雙側(cè)CCA，5 min后，復(fù)灌5 min，連續(xù)3次，末次灌注5 min后永久結(jié)扎右側(cè)CCA。連續(xù)3天腹腔注射青霉素鈉1.3萬U/100g消炎。第4天以相同的方法進(jìn)行左側(cè)CCA結(jié)扎，常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后10天存活有顯著學(xué)習(xí)記憶障礙的大鼠分別為單純?nèi)毖俟嘧⒛Ｐ秃兔}絡(luò)瘀滯合并再灌注血管性癡呆模型。正常假手術(shù)組只切開而不做缺血手術(shù)。除去淘汰的不合格鼠及手術(shù)死亡的動物，每組15只動物進(jìn)行實驗研究。

2.2 學(xué)習(xí)記憶行為的檢測

2.2.1 定位航行測試 將待測大鼠頭朝池壁放入Morris水迷宮其中一個象限，記錄大鼠找到水下平臺的時間(s)。在前幾次訓(xùn)練中，如果這個時間超過120 s，則引導(dǎo)大鼠到平臺，讓大鼠在平臺上停留10 s，將大鼠移開并擦干。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，兩次間隔20 min，連續(xù)5天。第6天測試，記錄逃避潛伏期(即大鼠從水中到找到平臺后四肢爬上站臺所需時間)、有效區(qū)停留時間及總路程等作為定位航行的檢測指標(biāo)。

2.2.2 空間搜索測試 定位航行測試后的第二天，將平臺撤除，開始120 s的探查測試。將大鼠由原先平臺象限的對側(cè)放入水中，記錄大鼠穿越虛擬平臺的次數(shù)，有效區(qū)停留時間，有效區(qū)停留距離等作為空間記憶的檢測指標(biāo)。

2.3 AchE活性和MDA含量測定

Morris水迷宮實驗結(jié)束后，將各組大鼠處死，取腦稱重后加9倍重量冰生理鹽水制備10%勻漿，離心取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行AchE活性和MDA含量測定。

3 結(jié)果

3.1 定位航行測試結(jié)果

表1 定位航行測試結(jié)果(±s，n=15)

表1 定位航行測試結(jié)果(±s，n=15)

注:與正常組相比※P＜0.05;與單純腦缺血再灌注模型組比△P ＜0.05。

組別 逃避潛伏期/s 有效區(qū)停留時間/s 總路程/m正常假手術(shù)組13.64 ±6.35 2.56 ±0.92 410.06 ±225.06單純腦缺血再灌注模型組 50.0±40.23※ 2.46±1.86 1668.14±1441.25※高脂+腦缺血再灌注模型組 92.26±39.9△※ 2.48±1.83 2812.16±1520.56△※

大鼠定位航行的實驗結(jié)果:由表1可以看出高脂+腦缺血再灌注模型組和單純腦缺血再灌注模型組在逃避潛伏期時間及總路程同正常假手術(shù)組間均存在顯著差異(P＜0.05);且高脂+腦缺血再灌注模型組在逃避潛伏期及總路程同單純腦缺血再灌注模型組間均存在顯著差異(P＜0.05);在有效區(qū)停留時間上各組并沒有顯著性差異(P＞0.05)。

3.2 空間搜索測試結(jié)果

表2 空間搜索測試結(jié)果(±s，n=15)

表2 空間搜索測試結(jié)果(±s，n=15)

注:與正常組相比※P＜0.05;與單純腦缺血再灌注模型組比△P ＜0.05。

/m正常假手術(shù)組組別 2min穿越平臺次數(shù)有效區(qū)停留時間/s 有效區(qū)停留距離3.14 ±1.77 4.25 ±1.60 142.89 ±51.28單純腦缺血再灌注模型組 1.38±1.19※ 2.61±1.16※ 94.24±40.62※高脂+腦缺血再灌注模型組 0.77±0.54※△ 1.89±1.25※ 60.28±34.45※

大鼠空間搜索測試結(jié)果:高脂+腦缺血再灌注模型組和單純腦缺血再灌注模型組在穿越平臺次數(shù)(/2min－1)、有效區(qū)停留時間及有效區(qū)停留距離同正常假手術(shù)組間均具有顯著差異(P＜0.05);且高脂+腦缺血再灌注模型組較單純腦缺血再灌注模型組在穿越平臺次數(shù)亦存在顯著差異(P＜0.05)。

3.3 AchE、SOD活性和MDA含量檢測結(jié)果

表3 各組大鼠AchE、SOD活性和MDA含量變化(±s，n=15)

表3 各組大鼠AchE、SOD活性和MDA含量變化(±s，n=15)

注:與正常組相比※P＜0.05;與單純腦缺血再灌注模型組比△P ＜0.05。

組 別 AchE/U·mg－1MDA/μmol·mg －1 0.375 ±0.032 1.544 ±0.310單純腦缺血再灌注模型組 0.658±0.1115※ 1.607±0.193高脂+腦缺血再灌注模型組 0.734±0.05※ 1.972±0.158正常假手術(shù)組※

腦組織AchE及SOD含量測定結(jié)果:大腦組織中每毫克蛋白中AchE含量兩模型組均高于正常假手術(shù)組，且均有顯著性差異(P＜0.05);而沒毫克蛋白中MDA含量僅高脂+腦缺血再灌注模型組同正常假手術(shù)組間存在顯著性差異(P＜0.05)。

4 討論

有關(guān)血管性癡呆的動物模型研究非常多，主要有M受體阻斷劑東莨菪堿致動物學(xué)習(xí)記憶障礙模型，興奮性氨基酸基底前腦注射致動物學(xué)習(xí)記憶障礙模型，正常老年動物模型，頸總動脈缺血再灌注模型以及轉(zhuǎn)基因動物模型等［2］。其中以雙側(cè)頸總動脈缺血合并再灌注動物模型在現(xiàn)代實驗研究中應(yīng)用最為廣泛。

VD是迄今為止唯一可防治的癡呆，如早期治療會具有可逆性。近年來，隨著中醫(yī)對VD研究的廣泛開展和深入，借助動物模型來進(jìn)行VD發(fā)病機(jī)制及療效方法的研究已越來越成為一種手段。由于動物模型不能全面反映VD的發(fā)病機(jī)理，現(xiàn)在多從某一方面或幾方面著手造模。如何研制比較接近VD臨床發(fā)病病因及證候的動物模型是我們今后努力的方向。中醫(yī)理論認(rèn)為癡呆的病因病機(jī)在于老年臟腑虛衰，腎精虧虛，腦髓不充，痰瘀阻絡(luò)?！堆C論》曰:“血在上，則濁蔽而不明矣”，痰瘀濁氣雜于腦髓，使清竅不清，元神失養(yǎng)，而靈機(jī)記性皆失，出現(xiàn)神志遲鈍，遇事善忘等癥狀。腎精虧虛，痰瘀互結(jié)，阻滯脈絡(luò)是VD發(fā)生的基礎(chǔ);痰瘀蘊(yùn)積，釀生濁毒，敗壞腦絡(luò)腦髓，是導(dǎo)致VD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。據(jù)此我們在中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上，根據(jù)老年人的發(fā)病特點(diǎn)，在給大鼠灌胃脂肪乳一段時間待其血脂升高的基礎(chǔ)上合并腦反復(fù)缺血再灌注初步建立了脈絡(luò)瘀滯型VD動物模型。這一造模方法既符合血管性癡呆腦組織缺血缺氧的病理變化，同時也符合中醫(yī)脈絡(luò)瘀滯的病因。

Morris水迷宮是目前評價動物學(xué)習(xí)記憶能力最常用的實驗裝置，主要包括定位航行實驗和空間搜索實驗。其中定位航行逃避潛伏期及空間搜索的穿越平臺次數(shù)作為反映動物學(xué)習(xí)記憶的主要指標(biāo)。逃避潛伏期越短及穿越平臺次數(shù)越多則說明動物的記憶能力越好［3］。本實驗研究結(jié)果表明，高脂+腦缺血再灌注模型組及單純腦缺血再灌注模型組同正常假手術(shù)組相比，其逃避潛伏期的時間和總路程均明顯增長，在2 min內(nèi)穿越平臺次數(shù)、有效區(qū)停留時間和距離均顯著縮短，在統(tǒng)計學(xué)上同正常假手術(shù)組存在顯著性差異，表明高脂+腦缺血再灌注模型組與單純腦缺血再灌注模型組均能引起動物的學(xué)習(xí)記憶能力下降;與此同時，高脂+腦缺血再灌注模型組在逃避潛伏期時間、總路程、2 min穿越平臺的次數(shù)及AchE較單純腦缺血再灌注模型組亦存在顯著性差異，說明高脂有可能是血管性癡呆發(fā)病的一個重要誘因［4］。

由以上結(jié)果可以看出，相比單純?nèi)毖俟嘧⒀苄园V呆動物模型，灌胃脂肪乳合并缺血再灌注血管性癡呆動物模型更接近VD中醫(yī)臨床發(fā)病病因和基本病理特征，能更有效地反映動物的學(xué)習(xí)記憶能力，有利于評價藥物對學(xué)習(xí)記憶過程的作用，不失為研究VD的理想動物模型。鑒于該實驗僅從動物行為學(xué)方面及腦組織AchE及SOD含量測定做了一些研究，在今后的工作中還需從病理變化及藥物反證方面進(jìn)行更深入的研究。

［1］Roman GC.Vascular dementia revisited:diagnosis，pathologenesis，treatment and prevention［J］.Medclin North Am，2002，86:477 －499.

［2］李斌，郭德云，李林.三種老年癡呆動物模型行為學(xué)比較［J］中國實驗動物學(xué)報，1999，7(1):37 －41.

［3］胡鏡清，溫澤淮，賴世隆.Morris水迷宮檢測記憶屬性與方法學(xué)初探［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2000，17(2):117 －119.

［4］唐啟盛，黃啟福，郭建文.高血脂癥大鼠腦缺血再灌注誘發(fā)行為學(xué)障礙動物模型的實驗研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1997，20(5):34－36.