★ 孫冬梅 羅文匯 李素梅 畢曉黎 李養(yǎng)學 (廣東省中醫(yī)研究所 廣州510095)

藥對是中藥配伍應用的基本形式，雖組成簡單，卻有著嚴謹?shù)呐湮橐?guī)律和特定的藥理作用。開展中藥藥對配伍的物質(zhì)基礎和作用機理研究對探討中藥配伍規(guī)律具有重要意義，同時也為更有效地指導臨床用藥和中藥新藥研制提供科學依據(jù)。黃連與吳茱萸配伍是中醫(yī)寒熱配伍藥對的代表之一，亦是現(xiàn)代臨床的常用藥對之一，有著良好的臨床療效和使用范圍。具有瀉火、疏肝、和胃、止痛等功效，屢經(jīng)歷代臨床應用至今不衰［1－2］。本文建立了同時測定血漿中黃連-吳茱萸藥對中四種生物堿濃度的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)方法，并進行了方法學考察。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，準確性好，樣品處理簡單，適合于黃連-吳茱萸藥對中生物堿的血藥濃度監(jiān)測及藥代動力學研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Accela高效液相色譜儀、TSQ Quantum Access Max三重四極桿質(zhì)譜檢測器(美國Thermo Fisher Scientific公司);TDL-5-L臺式離心機(上海安亭);HSC-12A氮吹儀(天津Hengao);XW-80A旋渦混合器(上海青浦滬西);Advantage A10超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品(批號:110713-200609)、鹽酸藥根堿(批號:110733-200806)、鹽酸巴馬汀(批號:110732-200506)、吳茱萸堿(批號:110802-200606)購于中國藥品生物制品檢定所;甲醇、冰乙酸(MERCK色譜純);高純氮氣(純度＞99.999%);高純氬氣(純度＞99.999%));水為超純水。

2 測定方法

2.1 對照品儲備液的配制

用40%甲醇溶液配制含鹽酸小檗堿(397.72 μg/ml)、鹽酸巴馬汀(396.94 μg/ml)、鹽酸藥根堿(399.36 μg/ml)和吳茱萸堿(395.28 μg/ml)的生物堿對照儲備液，置4℃冰箱中保存，使用時用40%甲醇水溶液稀釋至所需濃度。

2.2 樣品的處理

密吸取血漿樣品0.4 ml，加甲醇 1 ml，搖勻，離心(3000 r/min，15 min)，離心后傾出上清液，上清液加甲醇 1 ml，搖勻，離心(3000 r/min，15 min)，傾出上清液，上清液用氮吹儀吹干，殘渣加40%甲醇水溶液溶解并定容于1 ml容量瓶中，過0.45 μm的微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜條件［3－4］

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil GOLD C18柱(50 mm ×2.1 mm，3 μm);柱溫:30℃;流動相:甲醇(A)－0.01%乙酸(B)按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫;流速 0.2 ml/min;進樣量:10 μl。

表1 流動相梯度表

2.3.2 質(zhì)譜條件 高溫電噴霧離子源(HESI源);正離子選擇反應監(jiān)測(SRM);噴霧電壓:2.8kV;噴霧溫度:350℃;毛細管溫度:300℃;鞘氣壓力:35psi;輔助氣流速:5arb;用于定量分析的離子對為336.122→320.135(26Hz)、352.163→336.181(29Hz)、338.170→307.215(39Hz)和 303.114→286.965(42Hz)。

2.4 測定方法

測試樣品直接注入色譜儀中，按上述液-質(zhì)條件采用inject/waste的方式進樣檢測。

3 結(jié)果

3.1 方法可行性考察

空白血漿、對照品、血漿樣品的三個選擇反應監(jiān)測的離子流色譜圖見圖1－3。動物體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)不干擾樣品的分離測定。(見圖1－3)

3.2 標準曲線的制備

用40%甲醇水溶液將對照儲備液稀釋成含鹽酸小檗堿(1.243、4.971、9.943、15.486、22.886、30.578 ng/ml)、鹽酸巴馬汀(1.240、4.962、9.924、15.481、22.847、30.541 ng/ml)、鹽酸藥根堿(1.248、4.992、9.984、15.496、22.968、30.647 ng/ml)和吳茱萸堿(28.432、80.271、160.434、272.374、384.652、553.314 ng/ml)系列質(zhì)量濃度的生物堿對照品溶液，按“2.3”項下的測定條件進行分析、對待測物濃度C為自變量(X)，峰面積A為因變量(Y)，進行線性回歸分析，得到的直線回歸方程為:

圖3 空白血漿HPLC-MS色譜圖

鹽酸小檗堿:Y=9.039 47×105+2.526 9×106X，r=0.999 4，線性范圍為 1.243 ～30.578 ng/ml;鹽酸巴馬汀:Y=1.270 13 ×106+5.222 99 ×106X，r=0.999 5，線性范圍為 1.240 ～30.541 ng/ml;鹽酸藥根堿:Y=3.009 34 ×103+1.650 52 ×105X，r=0.999 2，線性范圍為 1.248 ～30.647 ng/ml;吳茱萸堿:Y=2.792 74 ×104X，r=0.999 4，線性范圍為 28.432 ～553.314 ng/ml。

3.3 回收率實驗

分別精密吸取1 ml空白血漿，分別加入高、中、低三種不同濃度的對照品溶液1 ml，混勻，制得三種濃度的血漿樣品，按血漿樣品的處理與測定項下方法進行測定，由標準曲線方程計算出血漿中生物堿濃度，以測得值與加入值之比計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 四種生物堿回收率測定結(jié)果

3.4 精密度試驗

將生物堿對照儲備液準確配制成低、中、高3個質(zhì)量濃度［含鹽酸小檗堿(1.243、9.943、30.578 ng/ml)、鹽酸巴馬汀(1.240、9.924、30.541 ng/ml)、鹽酸藥根堿(1.248、9.984、30.647 ng/ml)和吳茱萸堿(28.432、272.374、553.314 ng/ml)］的溶液，每個濃度平行配制6份，按HPLC-MS條件進行分析，計算日內(nèi)精密度，連續(xù)3天配制并測定上述濃度樣品，每天隨行做標準曲線，并以當日的標準曲線計算樣品的濃度。將結(jié)果進行方差分析，計算日內(nèi)精密度和日間精密度。低、中、高3個濃度日內(nèi)精密度RSD分別為鹽酸小檗堿:2.3%、3.2%、7.6%;鹽酸巴馬汀:2.6%、3.8%、6.5%;鹽酸藥根堿:2.5%、4.1%、8.2%;吳茱萸堿:1.7%、3.6%、6.8%。日間精密度分別為鹽酸小檗堿:2.5%、3.7%、8.5%;鹽酸巴馬汀:2.9%、4.0%、7.1%;鹽酸藥根堿:2.8%、4.7%、9.1%;吳茱萸堿:2.2%、4.5%、7.4%。均 ＜15%。

3.5 樣品穩(wěn)定性試驗

用空白血漿配制3個不同質(zhì)量濃度［含鹽酸小檗堿(1.243、9.943、30.578 ng/ml)、鹽酸巴馬汀(1.240、9.924、30.541 ng/ml)、鹽酸藥根堿(1.248、9.984、30.647 ng/ml)和吳茱萸堿(28.432、272.374、553.314 ng/ml)］的樣品，進行穩(wěn)定性試驗。結(jié)果表明在4℃條件下保存1周，樣品中藥物濃度無明顯變化，穩(wěn)定性良好。

3.6 質(zhì)控樣品

用空白血漿配制［含鹽酸小檗堿(1.243、9.943、30.578 ng/ml)、鹽酸巴馬汀(1.240、9.924、30.541 ng/ml)、鹽酸藥根堿(1.248、9.984、30.647 ng/ml)和吳茱萸堿(28.432、272.374、553.314 ng/ml)］樣品各3份，每份進樣分析2次，在每批樣品測試中作為質(zhì)控樣品和標準曲線進行隨行測定，結(jié)果表明質(zhì)控樣品的實際測定結(jié)果與真實值接近。

4 討論

黃連吳茱萸藥對生物堿在血漿中的濃度低，定量分析難度較大，采用常規(guī)方法進行分析測定靈敏度均無法滿足生物樣呂中微量藥物測定的要求。本研究采用LC-MS/MS法進行血漿中黃連吳茱萸藥對生物堿的測定，與HPLC-UV方法相比，本法的靈敏度高、專屬性強，與已有報道的LC-MS/MS方法相比，本法具有預處理方法簡單、分析時間短的優(yōu)點，適用于藥動學和生物利用度研究等生物樣本的分析測定。

［1］張紅梅，范穎.黃連與吳茱萸對藥方的應用沿革及配伍內(nèi)涵探析［J］.陜西中醫(yī)學院學報.2010，33(6):107 －108.

［2］楊宏博，肖小河，趙艷玲，等.黃連、吳茱萸藥對的研究進展［J］.中國藥房.2010，21(15):1432 －1434.

［3］鄧雅婷，廖瓊峰，畢開順，等.黃連-吳茱萸藥對化學成分的HPLCDAD-MS分析［J］.藥學學報.2008，43(3):299－302.

［4］涂瑤生，劉法錦，孫冬梅，等.黃連、吳茱萸配伍藥對的HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥.2011，33(1):5 －9.