★ 羅丹 劉智華 潘純國 朱根華＊＊ (.江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌330004;.江西省腫瘤醫(yī)院 南昌33009)

當歸為傘形科植物當歸Angelica Sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，藥用歷史悠久，歷代本草均有記載，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂之“當歸味溫，主呢逆上氣”被列為中品。主產(chǎn)于我國甘肅崛縣和宕昌，另外云南、四川、陜西、湖北等地亦有種植。當歸性甘、辛、溫，入肝、心、脾經(jīng)。具補血，活血，調(diào)經(jīng)，潤腸之功效［1－4］。，應(yīng)用 HPLC 法建立當歸的指紋圖譜，并對當歸中的8種成分進行了定性研究，為建立其質(zhì)量標準的提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(DAD檢測器、自動進樣器、柱溫箱);ChemStation工作站(Agilent科技有限公司，美國)，中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(國家藥典委員會，2004A版)，Millipore-Q超純水儀(Millipore Corporation，美國)，KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，BS224S型電子天平(賽多利斯，北京)。美國Waters ACQU ITY UPLC/Q-TOF-MS系統(tǒng)，采用電噴霧電離(ESI)，二元高壓泵、在線脫氣裝置、自動進器、柱溫箱和TUV檢測器。數(shù)據(jù)采集與處理采用Masslynx 4.1軟件。甲醇為色譜純(美國，TED I A公司)，甲酸為色譜純(美國，DIMA公司)，水為超純水器所制 (德國，Sartorius公司)。

1.2 試藥

甲醇(色譜純、默克公司)，乙酸(色譜純，Dikma)，超純水自制，實驗中當歸藥材來自于甘肅。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Phenomenex luna C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5μm);流動相:采用梯度洗脫，A相0.5%的乙酸水溶液，B相為乙腈;流速:1 ml/min，DAD檢測器，柱溫25°C線性洗脫程序見表1。采用二極管陣列檢測器對檢測波長進行了考察，分別記錄波長在210、270、330 nm的色譜圖。結(jié)果在270 nm處各色譜峰均有較好的紫外吸收，色譜信息最為豐富，并且分離度較好，可使主要色譜峰基本達到基線分離，分離效果較好，如圖1。

2.2 供試品的制備

取當歸藥材粉碎，準確稱取0.5g于具塞三角燒瓶中，加50%甲醇水溶液10 mL，超聲提取30 min，離心 5 min，0.45 μm 膜濾過，備用。

圖1 當歸270nm色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 分別精密吸取同一供試品溶液10μl按照上述色譜條件連續(xù)進樣5次，記錄指紋圖譜。以13號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積穩(wěn)定，RSD% ＜3.0，表明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 按照樣品溶液制備方法處理同一樣品5份，各吸取10μl按照上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄指紋圖譜。以13號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積穩(wěn)定，RSD% ＜3.0，表明該試驗方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液分別在0，2，4，8，12 h按照上述色譜條件連續(xù)進樣 5次，記錄指紋圖譜。以13號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積穩(wěn)定，RSD% ＜3.0，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 當歸藥材

HPLC-MS定性研究 本實驗通過 HPLC-MSESI正離子掃描獲得了當歸指紋圖譜的一些結(jié)構(gòu)信息，對指紋圖譜中的部分色譜峰進行了結(jié)構(gòu)歸屬的初步判斷，結(jié)合文獻報道，初步鑒定出8個指紋成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，見圖2，圖3，表1。

表1 HPLC-MS分析結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測波長的選擇 利用 DAD檢測器，對樣品進行全波長掃描，確定最佳檢測波長為270 nm。

3.1.2 流動相及洗脫方法的選擇 通過考察乙腈-0.5%醋酸，甲醇-水，甲醇-0.5% 醋酸，乙腈-水等多種流動相，最終確定流動相為:甲醇-0.5%醋酸，通過不同比例的甲醇-0.5%醋酸對樣品洗脫能力的考察和摸索，本實驗最終采用不斷調(diào)節(jié)流動相比例和極性，并能達到最佳的分離效果的梯度洗脫作為實驗條件。

3.1.3 流速的選擇 本實驗考察了不同流速(0.8，1.0，1.2 mL/min)對色譜圖的影響，1.2 mL/min和0.8 mL/min的流速分離效果差，1.0 mL/min的流速分離效果好且時間合適，符合指紋圖譜1 h的適宜時間，因此流速選擇1.0 mL/min。

3.2 樣品提取方法的選擇

本實驗分別采用超聲和回流提取方法，發(fā)現(xiàn)兩種方法所得組分相當，由于回流提取法較復(fù)雜，故本實驗采用超聲提取法根據(jù)不同種醇在不同濃度時的提取結(jié)果，得出甲醇提取效率充分，且70%的甲醇提取效率最佳最后確定樣品提取方法為70%甲醇超聲提取。

為了更有效地控制當歸藥材的質(zhì)量，使其符合現(xiàn)代中藥研究及質(zhì)量控制要求，本實驗對該藥材建立HPLC指紋圖譜，結(jié)果表明，這種方法穩(wěn)定，可靠并且簡便，同時充分體現(xiàn)其綜合化，宏觀化和可量化等優(yōu)于其他鑒別手段的優(yōu)勢，該法可用以對中藥材和中成藥進行真?zhèn)舞b別，評價原料藥材，半成品和成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性等，本實驗同時利用HPLC-MS等手段在獲得較多結(jié)構(gòu)信息的同時，對當歸化學(xué)成分進行了初步定性分析，鑒定出8個化合物，可為當歸化學(xué)成分的進一步研究及質(zhì)量控制提供參考［6－8］。

通過HPLC-TOF-MS確定的精確質(zhì)量數(shù)、可能分子式，并對HPLC-TRAP-MSn可采用正離子模式和負離子模式兩種，預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，正離子模式比負離子模式相比出峰多，響應(yīng)好。這可能與當歸中為有機酸，生物堿類的物質(zhì)，其比較容易形成［M+1］+或［M+Na］+，在負離子模式下都有很好的響應(yīng)，最后確定采用采集正離子模式下的總離子流圖。HPLC-TOF/MS，利用所得化合物離子的精確質(zhì)荷比進行分子式匹配。

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