孟慧玲，粱 真，于迎新，韓鳳梅，張清秀，李聰華

(河北省滄州市婦幼保健院，河北 滄州 061000)

雞胚絨毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrahe，CAM)是研究血管形成與抗血管形成的理想體內(nèi)模型，以雞胚絨毛尿囊膜為體內(nèi)模型研究血管新生藥物已成為熱點(diǎn)[1]。暖宮孕子膠囊具有滋陰養(yǎng)血、溫經(jīng)散寒、行氣止痛作用，是一種純中藥制劑，用于血虛氣滯、腰酸疼痛、經(jīng)水不調(diào)、赤白帶下、子宮寒冷、久不受孕等癥。研究證實(shí)暖宮孕子膠囊有改善克羅米芬促排卵患者雌激素抵抗的作用。為進(jìn)一步探討其機(jī)制，筆者就暖宮孕子膠囊對(duì)CAM血管生成的影響進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

MCO-5AC型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋電器集團(tuán));超凈工作臺(tái);倒置顯微鏡;眼科剪;眼科鑷;注射器;微量移液器及吸頭等。暖宮孕子膠囊(威特藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090224);雞胚(姚官屯種雞場(chǎng)提供);混合纖維素酯微孔濾膜(上海新亞凈化器材廠);氯化鈉注射液(河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為H13022576);乙醇(德州億申康消毒制品有限公司，批號(hào)為20030297);丙酮(天津市醫(yī)藥工業(yè)技術(shù)研究所，批號(hào)為860912);甲醇(天津市化學(xué)試劑二廠，批號(hào)為050310);新吉爾滅(山東瑞泰奇洗滌消毒科技有限公司，批號(hào)為20050149)。

1.2 試驗(yàn)操作

暖宮孕子膠囊制備成相當(dāng)于1 g/mL的藥液，裝入輸液瓶中，100℃熱水浴中處理30 min滅菌備用。將40枚雞胚隨機(jī)分為空白組和試驗(yàn)組，每組20枚。溫水沖洗干凈，1‰新吉爾滅紗布擦洗兩遍消毒，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度(37.8±0.3)℃，培養(yǎng)箱中放入水盤(pán)以保持濕度在40～70%，留通氣孔。每天轉(zhuǎn)蛋4次，有利于胚胎發(fā)育均勻，同時(shí)每日檢查胚胎發(fā)育情況，隨時(shí)淘汰死弱精蛋和死胚及發(fā)育不良的種蛋。第7天，置超凈工作臺(tái)上，用牙科砂輪在氣室上方蛋殼處磨切蛋殼，用眼科鑷開(kāi)1 cm×2 cm窗口，暴露下方的氣室膜，用注射器針頭在內(nèi)膜上輕輕劃破一小孔，勿傷及下面的CAM，用眼科鑷剝?nèi)馐夷ぃ瑢㈩A(yù)先剪成直徑5 mm并滅菌的混合纖維素酯微孔濾膜放在CAM兩條卵黃靜脈之間相對(duì)無(wú)血管處，試驗(yàn)組加入10μL暖宮孕子膠囊液，空白組加入10μL氯化鈉注射液。然后用滅菌的透明膠紙封閉假氣室，并將雞胚做好分組標(biāo)記，連續(xù)加藥3 d。

3 d后，加入甲醇 -丙酮(1∶1)的固定液，預(yù)固定15 min，待CAM的血管完全凝固后.用眼科鑷去掉CAM平面以上的卵殼和卵殼膜，并用眼科剪以濾紙載體為中心，完整剪下CAM，置盛有蒸餾水的平皿中，用眼科鑷舒展CAM，將載波片置人蒸餾水的平皿，將舒展的CAM平鋪其上，陰干保存。

血管計(jì)數(shù)，記錄以載體為中心，半徑1 mm內(nèi)為一級(jí)血管，半徑5 mm內(nèi)為二級(jí)血管，記錄一二級(jí)血管數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，雞胚存活率進(jìn)行 χ2檢驗(yàn);新生血管數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。

2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 CAM模型試驗(yàn)成活率

表2 兩組對(duì)CAM模型血管生成的影響

3 討論

王蕾等[2]研究發(fā)現(xiàn)，服用補(bǔ)腎生血藥如山茱萸、熟地、枸杞子、龜板膠、當(dāng)歸等后的小鼠血清，可促進(jìn)CAM的血管生成。張樹(shù)成等[3]在對(duì)補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，老年生理性腎虛的雌性金黃地鼠服用中藥后，子宮組織中血管數(shù)目顯著增加，樹(shù)枝狀分支廣泛，可見(jiàn)明確的血管出芽生長(zhǎng)，提示中藥具有促進(jìn)血管生成的作用。

CAM模型常用于血管新生促進(jìn)或抑制的研究，具有周期短、成本低、易于大樣本重復(fù)等特點(diǎn)，且觀察結(jié)果客觀可靠，是目前研究血管新生常用的活體模型之一 。有報(bào)道稱(chēng)直接加藥于雞胚CAM上，發(fā)現(xiàn)異物刺激過(guò)大、雞胚成活率降低，但本試驗(yàn)沒(méi)有發(fā)生此現(xiàn)象，試驗(yàn)中雞胚發(fā)育正常，且CAM血管生長(zhǎng)良好。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組一級(jí)血管和二級(jí)血管總數(shù)量均較空白組多，證明暖宮孕子膠囊具有促進(jìn)血管生成的作用。

暖宮孕子膠囊由熟地黃、香附、當(dāng)歸、川芎、白芍等藥物組成，以滋陰養(yǎng)血藥物為主。中醫(yī)理論中活血化瘀、益氣養(yǎng)血、補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)、填經(jīng)生血、止血生肌、行氣通脈等理論為中藥促進(jìn)血管生成的研究提供了依據(jù)。妊娠從著床到胎盤(pán)形成都離不開(kāi)豐富的血液供應(yīng)，離不開(kāi)血管新生、通透性改變。哺乳動(dòng)物胚胎植入的過(guò)程都伴有豐富的血管生成[4]。本研究顯示暖宮孕子膠囊對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成有促進(jìn)作用，可以推斷暖宮孕子膠囊可能是通過(guò)促進(jìn)血管生成而改善促排卵過(guò)程中的子宮內(nèi)膜厚度，進(jìn)而改善克羅米芬促排卵導(dǎo)致的高排卵率、低妊娠率。這為克羅米芬聯(lián)合暖宮孕子膠囊促排卵提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)，但暖宮孕子膠囊促進(jìn)CAM血管生成的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

[1]薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社，2001:2.

[2]王 蕾，張樹(shù)成，吳志奎，等.雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型在中藥研究中應(yīng)用方法探討[J].中藥藥理與臨床，2000，16(6):46-47.

[3]張樹(shù)成，吳志奎，王 蕾，等.補(bǔ)腎生血和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥促血管生成作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)雜志，2000，41(6):369.

[4]Ong S，Lash G，Baker PN.Angiogenesis and placental growth in normal and compromised pregnancies[J].Baillieres Best Pzact Res Clin Obstet Gynaceol，2000，14(6):969-980.