高燕 粱丹紅 宋薇 杜冀暉 張厚德 徐克成

·論著·

藥理濃度抗壞血酸誘導胰腺癌PANC1細胞的死亡方式及機制研究

高燕 粱丹紅 宋薇 杜冀暉 張厚德 徐克成

目的探討抗壞血酸(Asc)對胰腺癌PANC1細胞的生物學影響及其作用機制。方法PANC1細胞用不同濃度(0～40 nmol/L)Asc處理24、48、72 h。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法觀察Asc對胰腺癌PANC1細胞增殖的影響，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率，倒置顯微鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)，應用JC-1染色流式細胞儀檢測線粒體膜電位。同時，觀察Asc對抗氧化劑過氧化氫酶(catalase)及紅細胞(RBC)預處理的PANC1細胞形態(tài)及線粒體膜電位的影響。結果藥理濃度Asc選擇性抑制PANC1細胞增殖，并呈濃度、時間依賴性。5 mmol/L Asc處理后PANC1細胞被阻滯在G2/M期[(32.55±7.14)% 比(22.00±1.27)%，t=5.808，P<0.05]，但凋亡率未見增加[(1.98±1.80)% 比(1.09±0.16)%]?！? mmol/L Asc誘導PANC1細胞發(fā)生脹亡性死亡，細胞線粒體膜電位呈濃度依賴性明顯降低。catalase及RBC預處理能明顯抑制細胞線粒體膜電位的下降，減輕細胞發(fā)生脹亡的程度。結論Asc在體外對胰腺癌PANC1細胞有明顯的增殖抑制作用。Asc誘導PANC1細胞發(fā)生脹亡性死亡，而不是凋亡，其機制可能與線粒體膜電位下降有關。

胰腺腫瘤； 抗壞血酸； 細胞死亡； 過氧化氫； 線粒體膜電位

抗壞血酸(ascorbic acid，Asc)又稱維生素C，它在腫瘤治療中的作用一直頗具爭議。近幾年的藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，Asc通過不同途徑給藥(靜脈、口服)產(chǎn)生的血藥濃度完全不同，不具有可比性[1]。自此人們開始重新認識Asc的抗腫瘤作用。Chen等[2-3]最近報道，靜脈給藥能獲得的藥理濃度使Asc具有選擇性殺傷腫瘤細胞的作用，這種殺傷作用與過氧化氫的產(chǎn)生有關。另一方面，Asc作為營養(yǎng)補充劑廣泛應用于臨床已多年，具有安全、低廉、無明顯不良作用的優(yōu)點，故其抗腫瘤作用更加引人注意。目前尚未見Asc對胰腺癌作用的相關報道。為此，本研究觀察Asc對胰腺癌PANC1細胞株的生物學效應，初步探究其作用機制，為尋找治療胰腺癌的理想藥物提供線索。

材料與方法

一、細胞增殖檢測

人胰腺癌細胞株PANC1和正常人肝細胞株HL-7702由深圳市第六人民醫(yī)院中心實驗室饋贈，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。接種適量對數(shù)生長期細胞于96孔培養(yǎng)板，實驗分Asc組、三氧化二砷(As2O3)組、過氧化氫(H2O2)組和常規(guī)培養(yǎng)對照組。Asc組培養(yǎng)液內(nèi)加入0.3、1.0、2、5、10、15、20、40 mmol/L的Asc(Sigma公司)；As2O3組加入32 μmol/L的As2O3；H2O2組加入50 μmol/L的H2O2；只加培養(yǎng)液作空白對照。每組設3個復孔。加藥后培養(yǎng)24、48、72 h，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測。以空白對照孔調(diào)零，酶標儀測定各孔490 nm波長的吸光度(A490值)。細胞存活率(%)=(實驗組A490值-空白組A490值)/ (對照組A490值-空白組A490值)×100%。應用GraphPad Prism軟件繪制劑量反應曲線，并計算半數(shù)抑制濃度(IC50值)。

二、細胞死亡檢測

制備各組細胞爬片，每6 h在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并攝片。

另將PANC1細胞接種至75 cm2培養(yǎng)瓶中，應用10 mmol/L Asc處理12、24 h，用細胞刮收集約5×106個細胞至EP管，離心棄上清，加入電鏡固定液1 ml，再次離心后4℃保存送檢。經(jīng)脫水、浸透、包埋、修塊、制備切片后用透射電子顯微鏡(Philips CM10型)觀察細胞超微結構。

三、細胞周期及凋亡檢測

PANC1細胞接種于24孔板，分別加入0.3、5、20 mmol/L的Asc，32 μmol/L的As2O3，50 μmol/L的H2O2，以PBS作為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各孔細胞至相應流式管，離心、棄上清，加入PI染液(0.1 g/L)0.5 ml/管，4℃避光染色30 min，于1 h內(nèi)流式細胞儀檢測，利用MultiCycle 軟件行細胞周期分析，亞二倍體(Sub)-G1期細胞比率即為凋亡率。

四、細胞線粒體膜電位(△Ψm)的檢測

采用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，Sigma公司)。PANC1細胞接種于24孔板。分為陰性對照組，5、20 mmol/L Asc組，H2O2組(50 μmol/L)和CCCP組(CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，作為陽性對照)，培養(yǎng)24 h。CCCP在收集細胞前30 min加入，終濃度10 μmol/L。收集細胞，離心去上清，調(diào)整每個試管細胞數(shù)為1.5×105個，每管加入500 μl JC-1(5×)染色工作液，混勻，37℃避光孵育20 min，用JC-1(1×)緩沖液1 ml洗滌2次，棄上清后每管用500 μl JC-1(1×)緩沖液懸浮細胞。流式細胞儀檢測熒光顏色(激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm)。MnY/MnX示紅色熒光與綠色熒光的比值，比值降低提示線粒體膜電位降低。FL-Green表示綠色熒光所占百分比，其值越高提示線粒體膜電位下降越明顯。

五、過氧化氫酶(catalase)干預

應用細胞外抗氧化劑過氧化氫酶(catalase，Sigma 公司，100 μg/ml)預處理細胞30 min，再加入10 mmol/L Asc作用24 h，分別行電鏡觀察及線粒體膜電位(△Ψm)檢測。

六、紅細胞干預

取健康人肝素抗凝血2 ml，離心沉淀紅細胞(RBC)。吸取RBC，按25%、50%的血細胞比容(HCT)比例加入PANC1細胞培養(yǎng)體系，再分別加入0.3、1.0、2、5、10、15、20、40 mmol/L Asc作用1 h，棄上清，PBS液洗滌1次去除RBC，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別進行電鏡觀察及MTT檢測。

七、統(tǒng)計學處理

結 果

一、Asc對PANC1細胞增殖的影響

隨著Asc濃度增加、作用時間延長，PANC1細胞存活率逐漸降低(圖1)。Asc處理PANC1細胞24、48、72 h的IC50分別為4.432、2.070、1.093 mmol/L。同等條件下Asc對正常人肝細胞株HL-7702生長無明顯抑制作用，其IC50>100 mmol/L。兩者差異具有統(tǒng)計學意義(t=-22.265，P<0.01)。

圖1 不同Asc濃度、不同培養(yǎng)時間PANC1細胞的存活率

二、細胞形態(tài)及超微結構的變化

作用12 h開始，≥5 mmol/L的Asc各組和H2O2處理組細胞的體積變大，密度稀疏；24 h時見大量細胞腫脹、變大、變圓；48 h時細胞溶解成碎片、崩解死亡。As2O3組24 h可見懸浮細胞明顯增多，細胞固縮、體積變小呈圓形，細胞質(zhì)內(nèi)顆粒明顯，細胞碎片較少(圖2)

圖2對照組(a),10 mmol/L Asc處理24(b)、48 h(c)組，H2O2組(d)，As2O3組(e)PANC1細胞的形態(tài)學改變(×100)

對照組細胞外形完整，膜上絨毛豐富，線粒體等細胞器形態(tài)正常(圖3a)。10 mmol/L Asc處理組12 h時見線粒體腫脹，內(nèi)嵴減少縮短，細胞核染色質(zhì)疏松(圖3b)，24 h時整個細胞類似氣球樣變，胞質(zhì)中見大量空泡形成，線粒體腫脹、嵴消失，胞核腫脹、核內(nèi)染色質(zhì)分散、凝集在核膜及核仁周圍，以后核溶解，外膜消失、基質(zhì)透明呈氣球樣，未見凋亡小體及凋亡表現(xiàn)(圖3c)。H2O2處理組細胞超微結構變化與Asc組相似(圖3d)。

圖3對照組(a)，ASc 12 h(b)、24 h(c)組，H2O224 h組(d)細胞的超微結構(×5000)

三、細胞周期及凋亡率

Asc作用于PANC1細胞48 h后，G2/M期細胞呈劑量依賴性明顯增多，5、20 mmol/L組與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(t=5.808、7.821，P值均<0.05；表1)；G0/G1期細胞比例逐漸減少，20 mmol/L組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.464，P<0.05)；Sub-G1期細胞比例無明顯變化。H2O2組細胞的周期變化與Asc組一致(表1)。As2O3組細胞的Sub-G1期細胞比例明顯升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=12.686，P<0.05；表1)。

表1 各組PANC1細胞周期的變化

注：與對照組比較，aP<0.05

四、PANC1細胞線粒體膜電位(△Ψm)變化

Asc處理后細胞線粒體膜電位呈劑量依賴性明顯降低，表現(xiàn)為MnY/MnX的比值下降和FL-Green百分比增加，與H2O2組變化一致(表2)。

五、Catalase對Asc介導的PANC1細胞死亡的影響

Catalase預處理30 min再經(jīng)10 mmol/L Asc處理，細胞體積略增大，線粒體、胞核腫脹程度均較未預處理組明顯減輕(圖4a)，而細胞線粒體膜電位較未處理組明顯增加，恢復到對照組水平(表2)。

組別MnY/MnXFL?Green(%)對照組3．61±0．24．45±0．27Asc 5mmol/L組3．04±0．12a8．47±0．97a 20mmol/L組2．35±0．03ab14．40±0．50abCCCP組1．94±0．21a56．2±2．55aH2O2組3．10±0．11a9．8±1．13aAsc5mmol/L+catalase組3．53±0．23c5．29±0．07cAsc20mmol/L+catalase組3．39±0．15c7．6±1．04c

注：與對照組比較，t=3.374～30.328，aP<0.05；與5 mmol/L Asc組比較，t=3.413、-9.412，bP<0.05；與相應Asc組比較，t=-3.272、5.664、11.776、10.207，cP<0.05

六、RBC對Asc介導的PANC1細胞死亡的影響

PANC1細胞培養(yǎng)體系加入不同比積的RBC以模擬血管內(nèi)環(huán)境，再經(jīng)5 mmol/L Asc處理后，PANC1細胞較未加RBC組體積略增大，線粒體、胞核腫脹均明顯減輕,細胞脹亡性損傷的表現(xiàn)亦明顯減輕(圖4b)。對照組、加25%及加50% RBC的對照組的細胞存活率分別為(90.00±4.11)%、(87.62±3.88)%、(93.25±4.03)%，無明顯變化。Asc處理組、加25%及加50%RBC的Asc處理組的細胞存活率分別為(33.16±4.39)%、(81.22±3.81)%、(88.94±4.53)%，逐漸恢復到對照組水平。其Asc的IC50為40.63 mmol/L，明顯高于未加RBC的IC50(4.432 mmol/L，t=3.374，P<0.01)。

圖4 經(jīng)catalase、RBC干預后的細胞超微結構(×500)

討 論

對于腫瘤患者是否應該使用Asc的爭論持續(xù)了多年。早在上世紀七十年代，著名的諾貝爾獎獲得者Pauling就發(fā)表了每日10g Asc可延長腫瘤患者生存時間的論文[4-5]。但隨后，在Mayo醫(yī)院進行的兩項雙盲對照研究中，研究者發(fā)現(xiàn)每日10 g Asc對腫瘤患者生存并沒有明顯影響[6-7]。于是，Asc作為抗腫瘤藥被棄用。隨著Asc藥代動力學研究的深入，人們對它在腫瘤治療中的作用有了全新的認識。近年的研究[1]顯示，相同劑量Asc通過不同的給藥途徑所產(chǎn)生的血漿濃度截然不同，靜脈給予10 g Asc所產(chǎn)生的血藥濃度可達約6 mmol/L，是同一劑量口服給藥所產(chǎn)生的血藥濃度的25倍以上。靜脈給藥所產(chǎn)生的血藥濃度可達0.3～15 mmol/L，而口服給藥所產(chǎn)生的最大血藥濃度不超過0.22 mmol/L。Pauling等當時采用的是口服與靜脈給藥，而Mayo醫(yī)院采用的僅僅是口服給藥，所以這些研究結果之間無法進行比較。由此，Asc的抗腫瘤作用重新引起了人們的興趣。最近，Chen等[2-3]模擬臨床靜脈給藥途徑重新對Asc的抗腫瘤作用進行研究，發(fā)現(xiàn)藥理濃度Asc對一些腫瘤細胞具有選擇性殺傷作用，而這種作用與細胞外過氧化氫的產(chǎn)生有關。但Asc對胰腺癌細胞作用尚不清楚。

本研究結果顯示，Asc對胰腺癌PANC1細胞增殖有明顯的抑制作用，并呈濃度、時間依賴性。藥理濃度Asc對PANC1細胞有顯著的細胞毒作用，但對正常人肝細胞株HL-7702生長無明顯抑制，表明Asc對腫瘤細胞具有選擇性殺傷作用。從細胞周期來看,Asc使PANC1細胞受阻于G2/M期,但對Sub-G1期細胞比例無明顯影響，表明Asc抑制PANC1細胞增殖，但并未誘導凋亡。

本研究通過光鏡及電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Asc作用后，胰腺癌PANC1細胞形態(tài)學變化特征明顯有別于經(jīng)典的凋亡表現(xiàn)，而與近年來提出的一種細胞死亡方式——脹亡(oncosis)一致[8-10]。同時，Asc可導致PANC1細胞線粒體膜電位降低。細胞外抗氧化劑catalase能明顯抑制Asc介導的細胞線粒體膜電位下降，減輕細胞發(fā)生脹亡的程度。提示Asc介導的PANC1細胞死亡可能與細胞外某種能被catalase抑制的物質(zhì)誘導線粒體膜電位下降有關。而紅細胞可拮抗Asc對PANC1細胞的細胞毒作用，提示Asc誘導的這種物質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)生在組織中，而不是血管中。

對于Asc介導的細胞死亡機制，Chen等[2-3]報道，藥理濃度Asc對腫瘤細胞的殺傷作用直接與細胞外Asc作為電子供體誘導H2O2產(chǎn)生相關，也就是說Asc是通過作為前藥傳遞H2O2至組織而對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒作用的。本結果顯示，H2O2對PANC1細胞產(chǎn)生的生物學效應與Asc及其相似。結合catalase能明顯抑制Asc介導的細胞線粒體膜電位下降，減輕細胞發(fā)生脹亡的程度以及Chen等的研究結果，我們推斷細胞外某種能誘導線粒體膜電位下降的物質(zhì)就是H2O2。有研究報道，活性氧族(包括H2O2)可能通過對膜蛋白造成氧化損傷、線粒體通透性增加、抑制呼吸鏈的電子傳遞、ATP 水平下降等機制參與細胞脹亡的發(fā)生[11]，由此我們推測Asc介導產(chǎn)生的H2O2可能是通過降低線粒體膜電位，干擾線粒體能量合成，進而介導PANC1細胞發(fā)生缺乏ATP的被動死亡——脹亡。RBC拮抗Asc對PANC1細胞毒作用的結果進一步證實Asc誘導的H2O2產(chǎn)生發(fā)生在組織中，而不是血管中。這與紅細胞內(nèi)豐富的catalase和谷胱甘肽過氧化物酶使血管內(nèi)Asc產(chǎn)生的H2O2被快速分解代謝有關[12]。所以只有轉(zhuǎn)運至組織中的Asc產(chǎn)生的H2O2可以聚集起來發(fā)揮細胞毒作用，這也解釋了為什么只有達到一定濃度的Asc才具有殺傷作用，而口服給藥因產(chǎn)生的血藥濃度過低，轉(zhuǎn)運至組織的Asc過少而無法起效。那么，在人體應用時，究竟有多少Asc能逃過血管內(nèi)豐富的抗氧化劑的分解代謝作用進入組織內(nèi)？Asc在體內(nèi)能產(chǎn)生和體外一樣的效應嗎？這些問題值得進一步研究。

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ThedeathwayanditsmechanismsofpancreaticcancerPANC1cellsinducedbypharmacologicascorbicacidconcentrations

GAOYan,LIANGDan-hong,SONGWei,DUJi-hui,ZHANGHou-de,XUKe-cheng.
NanshanHospital,GuangdongMedicalCollege，Shenzhen518052,China

ZHANGHou-de,Email：szzhanghoude@126.com

ObjectiveTo investigate the biological effects and its mechanisms of ascorbic acid on pancreatic cancer PANC1 cells.MethodsPANC1 cells were treated by ascorbic acid of different concentrations (0～40 mmol/L) for 24,48,72 hours. The proliferation of PANC1 cells was analyzed by MTT method; cell cycle and apoptosis were assessed by flow cytometry (FCM); inverted microscopy and transmission electron microscopy were used to observe cell morphology. The membrane potential of mitochondria were mearured by with JC-1 staining and FCM. Meanwhile, the changes of cell morphology and mitochondrial membrane potential induced by ascorbic acid after pretreatment with hydrogen peroxide-scavenging enzyme (catalase) and red blood cells were also detected.ResultsAscorbic acid in pharmacologic concentrations selectively inhibited the proliferation of PANC1 cells in a dose and time dependent manner. PANC1 cells were arrested in G2/M phase after treatment with 5 mmol/L ascorbic acid [(32.55±7.14)%vs(22.00±1.27)%,t=5.808,P<0.05], but there was no changes on apoptosis rate [(1.98±1.80)%vs(1.09±0.16)%]. Inverted microscope and transmission electron microscopy showed that oncosis-like cell death of PANC1 cells was induced after treatment with ≥5 mmol/L ascorbic acid. Mitochondrial membrane potential of PANC1 cells was significantly lower than that of the control group in a dose dependent manner. The descent of mitochondrial membrane potential was significantly inhibited by pretreatment with catalase and red blood cells, and the degree of cell oncosis was attenuated.ConclusionsAscorbic acid significantly inhibited the proliferation of pancreatic cancer PANC1 cells in vitro. Ascorbic acid induced PANC1 cell oncosis, but not apoptosis. The possible mechanisms of inducing oncosis may be related to the descent of mitochondrial membrane potential.

Pancreatic neoplasms; Ascorbic acid; Cell death; Hydrogen peroxide; Membrane potential, mitochondrial

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.007

遼寧省博士啟動基金(20081044)；遼寧省教育廳基金(L2010627)

518052 深圳，廣東醫(yī)學院附屬南山醫(yī)院消化內(nèi)科(高燕、杜冀暉、張厚德)；東莞市中醫(yī)院消化內(nèi)科(梁丹紅)；廣東省中醫(yī)院內(nèi)分泌科(宋薇)；廣州復大腫瘤醫(yī)院(徐克成)

張厚德，Email：szzhanghoude@126.com

2011-09-06)

(本文編輯：屠振興)