劉貝 肖雨 朱麗明 喬新偉 向紅丁 陳杰 陳原稼

·論著·

神經(jīng)中間絲蛋白NF-66與胰島素瘤良惡性的關系

劉貝 肖雨 朱麗明 喬新偉 向紅丁 陳杰 陳原稼

目的探討神經(jīng)中間絲蛋白NF-66能否作為判斷胰島素瘤良惡性的分子標志物。方法采用免疫組織化學染色法檢測胰島素瘤組織、瘤旁胰腺組織及3株胰島素瘤細胞株NF-66蛋白的表達，應用單因素及多因素統(tǒng)計分析胰島素瘤NF-66蛋白表達與腫瘤病理特征及患者預后的相關性。結(jié)果132例胰島素瘤組織中102例(77%)表達NF-66蛋白,98例瘤旁胰腺組織均未見該蛋白表達(P=4.86×10-31)；3株胰島素瘤細胞株均高表達NF-66蛋白。118例良性胰島素瘤中96例(81%)表達NF-66,而14例惡性胰島素瘤中6例(43%)表達NF-66，惡性胰島素瘤的表達顯著下降(P=0.003)。胰島素瘤NF-66表達與腫瘤大小(以3 cm為界)、遠處轉(zhuǎn)移、遠處并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈顯著負相關(46%比81%,P=0.009；38%比81%,P=0.013；43%比81%,P=0.010)；而與患者性別、年齡、腫瘤復發(fā)和生存狀態(tài)不相關。結(jié)論胰島素瘤中NF-66表達下調(diào)與腫瘤的惡性生物學特征有關，可能成為潛在的鑒別胰島素瘤良惡性的分子標志物。

胰島素瘤; 中間絲蛋白質(zhì)類; 診斷，鑒別; 預后

胰島素瘤是少見的腫瘤,其發(fā)生的分子機制尚未闡明[1-3]。臨床上主要根據(jù)腫瘤有無淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移以及有無周圍組織、器官侵襲來判斷其良惡性[1-4]。如果惡性胰島素瘤處于早期階段,沒有侵襲或轉(zhuǎn)移的證據(jù),單純依靠病理形態(tài)學無法鑒別,因此探索和發(fā)現(xiàn)鑒別胰島素瘤良惡性的分子標志物具有重要臨床意義。我們曾采用差異蛋白組學的方法發(fā)現(xiàn)神經(jīng)中間絲蛋白NF-66在胰島素瘤高表達,而瘤旁組織及正常的胰腺組織中未見表達(結(jié)果待發(fā)表)。本研究在較大的胰島素瘤樣本和胰島素瘤細胞株中檢測NF-66的表達,探討其作為鑒別胰島素瘤良惡性分子標志物的臨床價值。

材料與方法

一、標本來源及診斷標準

1990至2010年在北京協(xié)和醫(yī)院就診并手術(shù)切除腫瘤的132例胰島素瘤患者作為研究對象,96例瘤旁胰腺組織作為對照。胰島素瘤的診斷標準,參照我們已往發(fā)表的文章[5-6]。

二、免疫組織化學法檢測NF-66表達

小鼠抗NF-66(MAB5224)購自美國Chemicon公司,兔抗小鼠IgG/HRP購自北京中杉金橋生物試劑有限公司，工作濃度為1∶600。胞質(zhì)有棕黃著色者為陽性細胞，陽性細胞數(shù)占總細胞>20%為表達陽性。免疫組化的全部結(jié)果均經(jīng)過病理醫(yī)師復查。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測胰島素瘤細胞株NF-66表達

小鼠和大鼠胰島素瘤細胞株RIN-m購自北京欣源佳和科技公司，β-TC3、INS-1由中日友好醫(yī)院婁晉寧教授惠贈。置含10%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。常規(guī)提取細胞株蛋白,行蛋白質(zhì)印跡法。NF-66一抗的工作濃度為1∶200,β-actin作為內(nèi)對照。

四、統(tǒng)計學分析

用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行單因素分析,用logistic進行多因素分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、胰島素瘤患者的臨床資料和腫瘤病理特征

132例胰島素瘤患者中男性54例,女性76例，有2例患者系20年前就診,性別記載不詳；年齡14～74歲，中位年齡44歲。所有患者均為單發(fā)。126例有腫瘤部位記載，其中位于胰頭頸部62例,胰體尾部64例；131例有瘤體直徑記載，其中≥3 cm 13例,<3 cm 118例。病理確診良性118例,惡性14例。89例患者獲得隨訪，隨訪2～224個月，隨訪中位數(shù)為37.5個月。81例患者無瘤生存，3例患者帶瘤生存(包括2例腫瘤復發(fā)者)；3例患者不能明確是帶瘤生存還是無瘤生存；2例患者病死于腫瘤。

二、胰島素瘤組織和瘤細胞株中NF-66表達

胰島素瘤組織NF-66蛋白表達率為77%(102/132),瘤旁胰腺組織均無NF-66蛋白表達(P=4.86×10-31，圖1)。3株胰島素瘤細胞株均高表達NF-66蛋白(圖2)。

圖1胰島素瘤及瘤旁胰腺組織病理改變(a、c)及NF-66蛋白(b、d)表達(免疫組化染色，×100或×200)

圖2 3株胰島素瘤細胞株的NF-66蛋白表達

三、NF-66表達和胰島素瘤臨床病理特征的關系

單因素分析顯示，胰島素瘤NF-66表達與腫瘤大小、良惡性、腫瘤轉(zhuǎn)移呈顯著負相關，而與患者性別、年齡、腫瘤復發(fā)和患者的生存狀態(tài)均不相關(表1)。多因素分析顯示，NF-66的表達與腫瘤大小、良惡性、腫瘤轉(zhuǎn)移仍然呈顯著負相關,與患者預后和腫瘤原發(fā)部位呈相關趨勢(表1)。

討 論

胰島素瘤是最常見的胰腺內(nèi)分泌腫瘤之一,10%～16%為惡性[2,4]。北京協(xié)和醫(yī)院已收治胰島素瘤患者400例以上,其中惡性腫瘤比例為4.5%[7]。 雖然絕大部分胰島素瘤是良性,但畢竟有些患者因為是惡性而最終病死。由于臨床上缺乏有效的鑒別腫瘤良惡性的手段,在沒有腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的證據(jù)時,通常把腫瘤診斷為良性。本組有1例患者首次入院時因腫瘤僅1.2 cm，無轉(zhuǎn)移和侵襲，診斷為良性胰島素瘤。10年后患者再次來院就診,發(fā)現(xiàn)肝臟多處轉(zhuǎn)移瘤,而胰腺未見明顯占位。因此臨床上非常需要鑒別腫瘤良惡性的分子標記物。

表1 NF-66表達與胰島素瘤臨床病理特征的相關性

注：-表示未統(tǒng)計

NF-66是一種分子質(zhì)量為66000的神經(jīng)絲蛋白,其在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達[8-9],并且和神經(jīng)分化發(fā)育有關。NF-66在神經(jīng)母細胞瘤中高表達[10]。胰島素瘤是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的一員，因此,NF-66在胰島素瘤廣泛表達。本結(jié)果顯示，胰島素瘤NF-66蛋白表達率高達77%,在3株鼠源性胰島素瘤細胞株中也強表達。有價值的發(fā)現(xiàn)是惡性胰島素瘤的表達率較良性胰島素瘤明顯下降甚至不表達。單因素及多因素分析均顯示胰島素瘤NF-66的表達與腫瘤的良惡性、大小、轉(zhuǎn)移呈負相關，提示胰島素瘤NF-66蛋白的下調(diào)與腫瘤的惡性生物學行為相關，因此有可能作為潛在的鑒別胰島素瘤良惡性的分子標志物。

雖然我們隨訪了絕大多數(shù)的患者,且隨訪中位數(shù)也達到3年以上，但對于病程進展緩慢的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤而言[3],隨訪的時間仍不夠長,因此本組僅發(fā)現(xiàn)2例患者病死,3例患者帶瘤生存。因例數(shù)太少(僅5例),目前尚不能推斷該蛋白究竟有無判斷預后的價值。

[1] 陳原稼,吳海燕.胰島素瘤//李兆申,許國銘.現(xiàn)代胰腺病學.北京:人民軍醫(yī)出版社,2006:963-965.

[2] Jonkers YM, Ramaekers FC, Speel EJ. Molecular alterations during insulinoma tumorigenesis. Biochim Biophys Acta, 2007, 1775:313-332.

[3] Modlin IM, Oberg K, Chung DC, et al. Gastroenteropancreatic neuroendocrine tumours. Lancet Oncol, 2008, 9: 61-72.

[4] Gumbs AA, Moore PS, Falconi M, et al. Review of the clinical, histological, and molecular aspects of pancreatic endocrine neoplasms. J Surg Oncol, 81:45-53.

[5] Mei M, Deng D, Liu TH, et al. Clinical implications of microsatellite instability and MLH1 gene inactivation in sporadic insulinomas. J Clin Endocrinol Metab,2009, 94: 3448-3457.

[6] 蔣衛(wèi)君,劉彤華,陳杰,等.胰島素瘤頻發(fā)MEN-1抑癌基因及22q的雜合缺失及其意義.中華醫(yī)學雜志,2004,84:1705-1709.

[7] 趙玉沛, 叢林, 張?zhí)?等.胰島素瘤404例診治分析.中國實用外科雜志,2008,28:357-359.

[8] Shea TB, Beermann ML. Neuronal intermediate filament protein alpha-internexin facilitates axonal neurite elongation in neuroblastoma cells.Cell Motil Cytoskeleton,1999, 43:322-333.

[9] Rauch U, Klotz M, Maas-Omlor S, et al. Expression of intermediate filament proteins and neuronal markers in the human fetal gut. J Histochem Cytochem,2006,54:39-46.

[10] Foley J, Witte D, Chiu FC, et al. Expression of the neural intermediate filament proteins peripherin and neurofilament-66/alpha-internexin in neuroblastoma. Lab Invest, 1994, 71:193-199.

Expressionofneuronalintermediatefilamentprotein(NF-66)andrelationshipwithbenignandmalignancyofinsulinomas

LIUBei,XIAOYu,ZHULi-ming,QIAOXin-wei,XIANGHong-ding,CHENJie,CHENYuan-Jia.
DepartmentofGastroenterology,PekingUnionHospital，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China

CHENYuan-jia,Email:yuanjchen@gmail.com

ObjectiveTo investigate whether neuronal intermediate filament protein(NF-66) could be used as a molecular marker for the determination of malignancy of insulinoma.MethodsThe expression of NF-66 protein was detected in insulinoma and para-cancerous tissues and 3 insulinoma cell lines by immunohistochemistry staining. The relationship between the expression of NF-66 protein and the clinicopathological characteristics, survival was analyzed by univariate and multivariate statistical analysis.ResultsExpression of NF-66 was found in 102(77%) out of 132 insulinomas and none of 98 paired control (P=4.86×10-31). NF-66 was highly expressed in 3 insulinoma cell lines. The expression of NF-66 was found in 96 (81%) out of 118 benign tumors (P=0.003), while out of 14 malignant insulinomas, 6(43%) were found to express NF-66(P=0.003). The expression of NF-66 was significantly associated with tumor size (3 cm as the cut-off point), distant metastasis (38%vs81%,P=0.013) and distant plus lymph node metastasis (46%vs81%,P=0.009), respectively. The expression of NF-66 was not correlated with age, gender, recurrence and overall survival.ConclusionsDown-regulation of NF-66 was significantly associated with tumor malignancy, suggesting that NF-66 could be a potentially novel molecular biomarker to distinguish malignancy from benign insulinoma.

Insulinoma; Intermediate filament proteins; Diagnosis, differential; Prognosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.005

國家自然科學基金(30850002、8107205)；北京協(xié)和醫(yī)院衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點實驗室專項基金

100730 北京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科(劉貝、朱麗明、喬新偉、陳原稼),病理科(肖雨、陳杰),內(nèi)分泌科 衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點實驗室(向紅丁、陳原稼)

陳原稼，Email:yuanjchen@gmail.com

2011-08-21)

(本文編輯：呂芳萍)