黃 楊，李康婧，陳文霞

(廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，廣西南寧 530021)

有效的控制根管內(nèi)感染是牙髓血管化再生術(pulp revascularization)成功的關鍵因素，根管感染控制的方法包括根管預備(機械、化學)和藥物消毒。Banchs等(2004)［1］最早報告的臨床病例中采用了米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲硝唑三聯(lián)抗生素進行根管消毒，以后的學者多沿用該方法［2－4］。而在 Cehreli等［5］報告的一系列臨床病例中，所有病例均以氫氧化鈣進行根管消毒，部分病例采用了機械預備。然而，學者們對于根管消毒藥物的甄選以及根管是否需進行機械預備，仍存在不同的觀點。本研究通過采用不同的方法對根管進行感染控制，觀察處理后根管內(nèi)壁微環(huán)境的改變對骨髓間充質(zhì)干細胞生物學行為的影響，為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

新西蘭大白兔(廣西醫(yī)科大學動物實驗中心);低糖 DMEM培養(yǎng)基(含 100 mL/L FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL 鏈霉素)(Hyclone);ProTaper(Dentsply);細胞堿性磷酸酶活性染色試劑盒(GENMED);掃描電鏡(TESCAN);能譜儀(EDAX)。

1.2 兔骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)原代培養(yǎng)

選取3周齡新西蘭大白兔1只，處死后750 mL/L乙醇浸泡消毒。無菌環(huán)境中取出股骨，PBS沖洗3次，剪斷干骺端，用DMEM沖出骨髓，1000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃，50 mL/L CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，24 h細胞貼壁生長后，更換DMEM，以后隔日換液。待細胞生長融合達到80% ～90%時，2.5 g/L胰蛋白酶消化，1∶2比例常規(guī)傳代。

1.3 根管預備及消毒

收集5個新鮮拔除的患根尖周炎的下頜第三磨牙，共7個牙根，浸泡于生理鹽水中，－20℃保存。納入標準:牙冠齲損穿髓;X線片示根尖周稀疏區(qū)。排除標準:牙根縱裂;牙根未發(fā)育完成;患牙有治療史。冰凍牙齒緩慢復溫至室溫，超聲清除牙石，手術刀片刮除牙周膜，沿釉牙骨質(zhì)界去除牙冠，隨機分成3組進行處理。

A組:采用冠下法預備根管，用10號和15號K型銼疏通根管，ProTaper銼根據(jù)產(chǎn)品指導進行根管預備至主尖銼 F3，每次更換器械以 5 mL 52.5 mL/L次氯酸鈉液沖洗根管。預備完成后，將片劑米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲硝唑研磨成粉末，將等質(zhì)量的3種抗生素粉末與生理鹽水調(diào)和成糊劑，置根管內(nèi)進行消毒。

B組:采用冠下法預備根管，方法同A組。預備完成后，將氫氧化鈣糊劑置根管內(nèi)進行消毒。

C組:不進行機械預備，僅用5 mL 52.5 mL/L次氯酸鈉液沖洗根管后，以氫氧化鈣糊劑進行根管內(nèi)封藥消毒。

3組樣本根管口均以氧化鋅水門汀進行封閉，浸泡于生理鹽水中，4℃保存7 d后，取各組樣本以裂鉆去除根管口氧化鋅，5 mL 52.5 g/L次氯酸鈉液沖洗根管，150 g/L EDTA液超聲沖洗根管1 min。然后將各組樣本沿根管長軸縱向劈開牙根，暴露根管壁，共得到14個牙根片，分別浸泡于PBS中，超聲水浴處理5 min，4℃保存于含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的滅菌PBS液中。每組隨機抽取一個牙根片掃描電鏡觀察根管壁情況。

1.4 根管牙本質(zhì)壁對BMSCs生物學行為的影響

1.4.1 細胞接種和共同培養(yǎng)

各組牙根片用滅菌PBS液清洗3次，置24孔培養(yǎng)板中。將貼壁生長的第3代兔骨髓間充質(zhì)干細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，以104/mL密度接種于牙根片的根管內(nèi)壁。置37℃，50 mL/L CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24 h更換DMEM，以后隔日換液。

1.4.2 掃描電子顯微鏡觀察

于接種細胞第7天，各組隨機抽取1個牙根片分別以PBS洗3次，25 mL/L戊二醛4℃固定2 h，脫水，干燥，真空離子濺射鍍金，電鏡下觀察并對表面進行能譜分析。

1.4.3 細胞堿性磷酸酶染色

接種細胞第14天，取各組所余牙根片以滅菌PBS洗3次，用25 g/L胰蛋白酶37℃消化1 min，DMEM終止消化，1000 r/min離心5 min，重懸，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，另取一6孔板接種第3代兔骨髓間充質(zhì)干細胞，用于空白對照。然后將所有6孔板置37℃，50 mL/L CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

2 d后棄原培養(yǎng)基，加入清理液清洗細胞表面;棄清理液，加入固定液，室溫下孵育60 s;棄固定液，清理液清洗細胞表面3次。加入染色液，37℃暗室孵育30 min，清理液清洗。顯微鏡觀察，對陽性細胞和陰性細胞進行計數(shù)，計算陽性率。

2 結(jié)果

2.1 兔BMMSCs原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)24 h，可見大部分細胞貼壁生長，多數(shù)貼壁細胞外形呈長梭形的成纖維細胞樣或呈多邊形。48 h形成細胞克隆。細胞生長達到80%～90%融合時傳代，平均3 d傳代1次。傳代細胞生長旺盛，第3代以后形態(tài)穩(wěn)定，部分區(qū)域細胞呈漩渦狀生長(圖1)。

圖1 第3代兔骨髓干細胞，形態(tài)穩(wěn)定，部分區(qū)域細胞呈漩渦狀生長(倒置顯微鏡，×40)

2.2 掃描電鏡觀察

經(jīng)機械預備的A、B組根管內(nèi)壁牙本質(zhì)無明顯差別，根管內(nèi)壁均存在少量散在塊狀碎屑，部分牙本質(zhì)小管被碎屑封閉，多數(shù)牙本質(zhì)小管口呈開放狀，可見松散的膠原(圖2a、b)。未經(jīng)機械預備的C組根管內(nèi)壁分布有呈云霧狀的膠原纖維，基本無碎屑存在，多數(shù)牙本質(zhì)小管口開放(圖2c、d)。

A，B，C 3組牙本質(zhì)支架與兔骨髓干細胞復合培養(yǎng)7 d，掃描電鏡均可以觀察到細胞伸展充分，交疊生長呈網(wǎng)狀覆蓋根管內(nèi)壁(圖3)，形態(tài)呈多邊形，突觸多而不規(guī)則，附著于管間牙本質(zhì)，并互相連接，使胞體緊貼根管內(nèi)壁，但未發(fā)現(xiàn)有細胞突觸伸入開放的牙本質(zhì)小管內(nèi)的現(xiàn)象。個別細胞表面可見分泌的基質(zhì)小泡，大小、形態(tài)不一(圖4)。能譜分析其主要元素為鈣、磷、碳、氧。

2.3 堿性磷酸酶染色結(jié)果

以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)灰褐色至黑色沉淀作為堿性磷酸酶染色陽性結(jié)果。A，B，C 3個誘導組均有細胞表達堿性磷酸酶，呈不同程度的陽性反應(圖5)。3組的陽性率分別為:A組2.39%，B組32.59%、C組31.10%(表1)。統(tǒng)計學分析各組內(nèi)樣本間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，A組陽性率低于B組與C組(P ＜0.05)，B組和C 組無差異(P ＞0.05)。

表1 細胞堿性磷酸酶表達 (n=3)

圖2 根管內(nèi)壁表面情況

圖3 各組根管內(nèi)壁細胞粘附、生長情況

圖4 各組根管內(nèi)壁細胞生長情況和形態(tài)

圖5 各組細胞堿性磷酸酶活性染色(×40)

3 討論

牙髓再生是牙髓病和根尖周疾病臨床治療的理想目標，干細胞以及誘導干細胞遷移、分化的微環(huán)境，是牙髓血管化再生術和組織工程技術重建牙髓成功的必要條件。牙本質(zhì)是成牙本質(zhì)細胞分泌的細胞外基質(zhì)的礦化產(chǎn)物，由于具有組織結(jié)構(gòu)的多孔性，以及脫礦后可以釋放生物活性分子的特性，使其成為一種較理想的生物支架。近年來，許多研究陸續(xù)報道了各種牙源性干細胞與牙本質(zhì)支架復合體在體外或體內(nèi)培養(yǎng)的結(jié)果［6－9］，雖然處理方式不盡相同，但是都表明健康的牙本質(zhì)可以為種子細胞提供粘附、增殖和分化的微環(huán)境。其中牙本質(zhì)非膠原蛋白的作用已得到普遍認同，可以誘導成骨、成牙本質(zhì)分化，參與基質(zhì)形成和礦化的調(diào)控［10］。對于慢性根尖周炎患牙，細菌可侵入根管牙本質(zhì)小管深部達140 ～ 1000 μm［11］，因此，尋求有效控制感染同時使牙本質(zhì)內(nèi)生物活性成分釋放的手段，可以為臨床應用參考。

本研究采用不同的根管預備方法和不同的根管消毒藥物進行根管感染控制，采用處理后的根管內(nèi)壁牙本質(zhì)作為支架，在體外與BMMSCs進行復合培養(yǎng)。掃描電子顯微鏡下觀察可見經(jīng)過3種不同組合方式處理后的牙本質(zhì)壁表面均有細胞粘附生長，細胞突觸多而不規(guī)則，與成骨細胞較為相似。部分細胞表面可觀察到大小不一的基質(zhì)小泡，主要含鈣、磷、碳、氧元素。推測小泡內(nèi)含羥基磷灰石晶體。這表明3種組合處理后的根管內(nèi)壁均能為BMMSCs的生長提供適宜的微環(huán)境。采用機械處理的B、C兩組細胞形態(tài)和堿性磷酸酶染色無明顯差別，說明機械預備后，膠原纖維的減少和碎屑的殘留，對細胞附著與伸展的影響不明顯。

本研究在不同的處理組合中采用了米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲硝唑三聯(lián)抗生素與氫氧化鈣進行根管內(nèi)消毒。三聯(lián)抗生素糊劑作為牙髓血管化再生術臨床上用于根管消毒藥物的經(jīng)典組合，可以發(fā)揮廣譜抗菌作用，但其導致牙齒顏色的改變成為臨床應用的主要缺陷，另外有報道米諾環(huán)素能顯著抑制成骨細胞ALP的活性［12］。本研究試圖探討采用氫氧化鈣進行根管消毒對干細胞生長的影響。結(jié)果顯示:采用三聯(lián)抗生素的A組與采用氫氧化鈣的B組細胞堿性磷酸酶活性染色陽性率有顯著不同，這可能與三聯(lián)抗生素中的米諾環(huán)素抑制ALP活性有關;而氫氧化鈣是一種療效肯定的根管消毒藥物，在臨床上常作為蓋髓劑或誘導根尖形成的藥物，可以促進根尖硬組織沉積，也有研究證實氫氧化鈣具有提高成骨細胞堿性磷酸酶的活性的作用［13－14］。

本結(jié)果提示:①對感染根管不論是機械預備或單純采用有效的化學預備，結(jié)合超聲和根管內(nèi)藥物消毒，根管內(nèi)壁牙本質(zhì)均可以為干細胞的生長提供適宜的微環(huán)境;②氫氧化鈣可促進干細胞堿性磷酸酶的表達。但仍需要進一步的深入研究以增強臨床應用的可靠性。

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