馮 利，董跟喜，孫曉瑋

(甘肅蘭州730000:1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)

線粒體(mitochondria，Mi)作為凋亡的中心環(huán)節(jié)，已在許多凋亡系統(tǒng)中被證實(shí)。Smac(second mitochondria－derived activator of Caspase Smac)是一種由線粒體釋放的凋亡相關(guān)蛋白，Smac表達(dá)可增加細(xì)胞對凋亡刺激的敏感性。當(dāng)Mi接受凋亡信號后，Smac蛋白的Mi定位信號肽被切除，形成有活性的Smac蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，可與所有凋亡抑制蛋白IAPs結(jié)合，使其喪失抑制Caspase活性的作用，從而促進(jìn)凋亡［1］。Bax為促凋亡蛋白并具有多功能，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，一旦細(xì)胞受到凋亡因子的誘導(dǎo)后，便會從胞質(zhì)移位而伸入到Mi膜中，通過寡聚化在 Mi外膜形成 Bax通道［2］，促進(jìn)Cyt－C、Smac/Diablo、AIF 等釋放并進(jìn)入胞質(zhì)，使 bcl－2與Apaf－1分離，后者可激活 Caspase，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3－4］。Smac、Bax 蛋白是細(xì)胞凋亡過程中的重要誘導(dǎo)基因，本文旨在探討Smac、Bax在慢性牙周炎(Chronic Periodontitis，CP)齦組織的表達(dá)及其分布的意義。

1 材料和方法

1.1 病例篩選和樣本采集

27例CP標(biāo)本來自蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院門診病人因患牙不能保留的齦組織，其中男14例，女13例，年齡39～57歲?？趦?nèi)每個區(qū)有2個以上的牙牙周附著喪失≥4 mm，牙周袋﹥5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收超過根長的1/2，牙松動。另外再從門診病人中選擇牙周健康，所有牙附著喪失≤2 mm，因阻生或錯位而拔除牙的牙齦組織作為正常對照組，共27例，男12例，女15例，年齡37～55歲。所有病例均無全身性疾病，就診前3個月內(nèi)未服用抗生素和半年內(nèi)未做過牙周系統(tǒng)治療。在病人知情同意下拔除牙齒，CP組和健康組各12例取4 mm×4 mm×4 mm牙齦組織分成3份，40 g/L多聚甲醛固定，分別用作HE染色(核實(shí)病理診斷)和免疫組化染色;另取2組各12例標(biāo)本用25 mL/L戊二醛前固定，用作電鏡超薄切片處理;剩余2組各3例用于流式細(xì)胞儀檢測。

1.2 主要試劑

Smac－Diablo測定試劑盒(北京奧博森生物技術(shù)有限公司);Bax測定試劑盒(即用型)、SP－9000試劑盒(即用型)、DAB顯色劑(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司);羅丹明 123(RH123，Sigma)。

1.3 方法

1.3.1 HE 染色觀察

牙齦組織常規(guī)石蠟包埋，制作4 μm切片，HE染色，光鏡觀察。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測Smac、Bax蛋白的表達(dá)

組織切片脫蠟水化，微波修復(fù)，蒸餾水洗，30 mL/L過氧化氫液中和內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS漂洗，滴加一抗(兔抗小鼠Smac、Bax)4℃過夜，PBS洗滌，再加生物素化二抗，37℃ 20 min，PBS洗滌，滴加SABC 37℃ 20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水、透明，封片，鏡檢。以PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.3 牙齦組織超微結(jié)構(gòu)觀察

固定的牙齦組織用1/15 M PBS沖洗，10 g/L過氧化鋨液后固定，PBS漂洗，梯度乙醇脫水，浸透，EPON812包埋，熱聚合，制作超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸鈾染色，透射電鏡觀察。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位

將新鮮牙齦組織剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶消化(37℃)，PBS終止消化，200目和400目銅篩網(wǎng)分別過濾，離心，收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入終濃度為15 μg/mL 的Rh123，37℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，加500 μL PBS，上機(jī)檢測線粒體膜電位(△Ψm)熒光強(qiáng)度變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，并對Smac、Bax兩者之間的相互關(guān)系進(jìn)行l(wèi)inear regression分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙齦組織HE染色觀察

牙周炎齦組織中上皮釘突呈網(wǎng)狀突起伸入結(jié)締組織中，并可見凋亡的上皮細(xì)胞(圖1);結(jié)締組織水腫，有大量炎性細(xì)胞浸潤，其中有凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，核染色質(zhì)致密濃縮，核碎裂等，胞漿呈淡紅色，并分散于組織中(圖2)。膠原纖維排列紊亂，部分纖維發(fā)生斷裂。而健康牙齦組織上皮釘突較長，伸入結(jié)締組織中，炎性細(xì)胞較少，未見凋亡細(xì)胞。

2.2 牙齦組織超微結(jié)構(gòu)觀察

CP齦上皮細(xì)胞、結(jié)締組織中的漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞有凋亡發(fā)生，膠原原纖維破壞。上皮基底凋亡細(xì)胞核固縮，核膜部分突起，線粒體有形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)呈空泡;凋亡的漿細(xì)胞有核染色質(zhì)凝集、核周間隙寬窄不等、線粒體腫脹，空泡變等一些非特異性改變，細(xì)胞質(zhì)中可見多泡體和自噬體(圖3)。凋亡的成纖維細(xì)胞核固縮，凝集成塊，聚集在核膜周邊，RER變性，形成空泡，并有RER腔擴(kuò)張，壁向腔內(nèi)呈乳突狀增生，形成腔內(nèi)隔離;Mi內(nèi)外膜融合，嵴減少且紊亂(圖4)。凋亡的巨噬細(xì)胞可見核膜突出，染色質(zhì)凝集，Mi腫大，溶酶體增多等特異形態(tài)。健康齦上皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)未見凋亡現(xiàn)象。

2.3 牙齦組織細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm)

CP組織細(xì)胞△Ψm平均熒光強(qiáng)度(MFI=11.6±0.82)，明顯低于正常組織細(xì)胞△Ψm(MFI=14.5 ±0.98)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.4 免疫組化檢測Smac、Bax蛋白的表達(dá)

Smac、Bax蛋白的表達(dá)以細(xì)胞核不著色，胞質(zhì)被染成棕黃色或淺黃色者為陽性細(xì)胞。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行圖像分析(BI－2000圖像分析系統(tǒng))。結(jié)果顯示:正常齦組織和CP齦組織均有Smac、Bax陽性表達(dá)。在CP組織中Smac、Bax陽性表達(dá)主要位于上皮的棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層，炎性結(jié)締組織中可見漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞有陽性表達(dá)，淋巴細(xì)胞未見陽性表達(dá)(圖5～8)。CP齦組織中Smac、Bax在上皮組織、結(jié)締組織的表達(dá)增加，與正常齦組織相比差異均有顯著意義(P＜0.05)(表1)。

2.5 Smac、Bax蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

根據(jù)平均光密度采用linear regression分析，以Bax為自變量X，Smac為應(yīng)變量Y，根據(jù)散點(diǎn)圖的形式，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對正常齦組織、CP齦組織的Bax、Smac指標(biāo)建立linear regression模型。結(jié)果表明，在 CP組中兩者的表達(dá)具有正相關(guān)性(P ＜0.05)(表2)。

圖1 牙周炎上皮組織區(qū)凋亡的細(xì)胞(箭頭示)(HE，400×)

圖2 牙周炎結(jié)締組織區(qū)凋亡的細(xì)胞(箭頭示)(HE，400×)

圖3 凋亡的漿細(xì)胞 染色質(zhì)凝集，RER形成空泡，Mi腫脹，細(xì)胞質(zhì)中可見自噬體及多泡體(8000×)

圖4 凋亡的成纖維細(xì)胞 染色質(zhì)固縮，RER變性，Mi內(nèi)、外膜融合，嵴減少且紊亂(10000×)

圖5 Smac在正常牙齦組織中的表達(dá)(DAB，400×)

圖6 Smac在CP牙齦組織中的表達(dá)(DAB，400×)

圖7 Bax在正常牙齦組織中的表達(dá)(DAB，400×)

圖8 Bax在CP牙齦組織中的表達(dá)(DAB，400×)

表1 牙周組織中各測試區(qū)Smac、Bax蛋白表達(dá)的平均光密度比較(n=12，)

表1 牙周組織中各測試區(qū)Smac、Bax蛋白表達(dá)的平均光密度比較(n=12，)

組織Smac健康組 CP組 P值Bax健康組 CP組 P值上皮組織 0.210 ±0.050 0.263 ±0.057 0.025 0.216 ±0.068 0.266 ±0.044 0.044結(jié)締組織 0.383 ±0.103 0.493 ±0.114 0.021 0.375 ±0.077 0.417 ±0.114 0.019

表2 牙周組織中各測試區(qū)Bax、Smac蛋白表達(dá)的平均光密度regression分析

3 討論

CP是菌斑微生物與宿主免疫反應(yīng)相互作用所致的牙周組織破壞的炎癥性疾病，臨床觀察及動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):牙周組織的細(xì)胞凋亡與牙周組織的炎癥反應(yīng)和破壞程度呈正相關(guān)，凋亡細(xì)胞多見于炎癥細(xì)胞浸潤部位，即表淺的結(jié)合上皮和其下的結(jié)締組織［5－6］，據(jù)此，本研究在光鏡下選定測試區(qū)，以便觀察牙周組織表達(dá)Smac、Bax的全貌，了解病理變化的程度。

Mi形態(tài)改變與其功能改變和細(xì)胞活力降低密切相關(guān)。①細(xì)胞凋亡早期出現(xiàn)△Ψm降低，這種變化早于細(xì)胞凋亡的其他特征性變化，如核DNA片段出現(xiàn)，所以△Ψm的正常與否可作為凋亡的特征性標(biāo)志，而△Ψm的改變亦與Mi通透性變化相關(guān);②Mi內(nèi)外膜通透性的變化:△Ψm的降低提示Bax與ANT或VDAC相互作用促使MPTP(Mi permea bility transition pore，MPTP)開放，形成 Bax 通道，但當(dāng)細(xì)胞凋亡時，MPTP能將Bax集中到自身周圍，使通道持續(xù)開放，跨內(nèi)膜梯度消失，使呼吸鏈解耦聯(lián)，引起基質(zhì)高滲腔加大，Mi空泡化，Bax與BaK在外膜形成聚集灶，引起Cyt－C、Smac等促凋亡因子的釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡［7］。本結(jié)果顯示:牙周炎組的△Ψm明顯低于健康組，而且電鏡觀察可見凋亡細(xì)胞的Mi管狀結(jié)構(gòu)破壞，區(qū)室化消失，也表明Mi的功能變化(圖3～4)。

本研究免疫組化法檢測結(jié)果顯示:無論是橫向或縱向分析，CP組Smac、Bax陽性表達(dá)在上皮組織、結(jié)締組織均明顯高于健康對照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，提示在損傷組織表達(dá)明顯。CP組織中Smac與Bax的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(P﹤0.05)。說明Smac、Bax二者在線粒體內(nèi)源性凋亡途徑中發(fā)揮促凋亡的重要作用。但R2值比較低，可能由于樣本量少和其他因素的影響，今后有待進(jìn)一步探討。

根據(jù)慢性牙周炎齦組織的光鏡和電鏡觀察所見，上皮組織中凋亡細(xì)胞多位于基底層和棘細(xì)胞層，致使基底細(xì)胞不能進(jìn)行正常分化，引起上皮細(xì)胞的凋亡，結(jié)果造成牙周組織的損傷。結(jié)締組織中漿細(xì)胞的凋亡，降低宿主局部體液免疫功能，從而促進(jìn)牙周炎的發(fā)展。巨噬細(xì)胞根據(jù)其凋亡特異形態(tài)學(xué)變化，具有發(fā)揮完成吞噬凋亡細(xì)胞的利他作用，也通過凋亡發(fā)揮生理作用［8］。本研究認(rèn)為激活巨噬細(xì)胞的凋亡，是機(jī)體限制巨噬細(xì)胞的有害炎癥介質(zhì)對局部組織損傷的一種方式。成纖維細(xì)胞的凋亡，膠原纖維松散且斷裂無序，造成牙周膜的破壞，影響基質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化降低細(xì)胞的活性，其臨床意義在于引起牙周組織的喪失，牙周袋的形成，促進(jìn)牙周組織病變的發(fā)展。

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