李詩林，鄭銀英，崔百明，都業(yè)娟，喬亞紅，田桂英，向本春

（石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003）

蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）最早在1959年由英國學(xué)者Luckwill和Campbell報道，命名為大果海棠線斑病毒（Line pattern virus）。我國在1989和1993年由劉福昌等［1］首次報道了蘋果和梨樹的ACLSV等。蘋果褪綠葉斑病毒分布較廣，能侵染多種果樹，包括蘋果、梨、桃、李、櫻桃和杏，同時與其他病毒常常引起混合感染，造成樹勢衰退，果品產(chǎn)量和質(zhì)量均受嚴(yán)重影響［2－6］。目前，最有效的脫毒方法是采用熱處理和莖尖培養(yǎng)結(jié)合處理［7］，但在田間很難避免病毒的再度感染。近年來，利用RNA沉默實(shí)現(xiàn)植物抗病引起了植物病毒學(xué)研究的高度關(guān)注，并取得了進(jìn)展［8－10］，如朱俊華等獲得了馬鈴薯Y病毒壞死株系免疫抗病轉(zhuǎn)基因植株［10］。同時RNA沉默技術(shù)與其他的基因工程方法相比具有很大優(yōu)勢，如對核苷酸序列特異性、高效性、沉默信號的可遺傳性和持久性。

為此，本研究主要采用將ACLSV目標(biāo)基因的正向和反向重復(fù)序列分別插入到內(nèi)含子兩側(cè)，構(gòu)建RNAi干擾載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入西方煙中，通過對轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性檢測試驗(yàn)來評價各RNAi載體的干擾效果，旨在為研究該病毒的主要基因的功能，了解其關(guān)鍵致病因子，提供材料和理論依據(jù)，同時也為通過基因工程手段培育和大量繁殖具有高抗或免疫作用的無病毒栽培苗木奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2010年3－4月，自庫爾勒市、新疆兵團(tuán)農(nóng)二師28團(tuán)和29團(tuán)和沙依東園藝場采集庫爾勒香梨枝條。西方煙（Nicotiana occidentalis）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

用于構(gòu)建干擾載體的質(zhì)粒piRDG12、pBi35SG12、大腸桿菌E.coli DH5α和根癌農(nóng)桿菌GV1301均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

實(shí)驗(yàn)使用的Taq DNA聚合酶購自上海生工公司；限制性內(nèi)切酶為Frementas公司產(chǎn)品；克隆載體pGEM－T Easy Vector、M－MLV Reverse Transcriptase、T4DNA連接酶和凝膠電泳DNA回收試劑盒、植物總RNA提取試劑盒等購自Promega公司；DNA Markers購自東盛生物科技有限公司；其他試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1香梨枝條的培養(yǎng)

將采集的庫爾勒香梨枝條在植物培養(yǎng)室水培3周，待枝條萌發(fā)出新芽，采集幼嫩的新芽進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2植物總RNA的提取和cDNA的合成

從香梨嫩芽中提取植物總RNA，方法依照Promega公司SV Total RNA Isolation System說明書操作完成。cDNA模板第一鏈的合成，根據(jù)Promega公司M－MLV Reverse Transcriptase的說明書合成。

1.2.3引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank收錄的ACLSV基因序列，應(yīng)用VectorNTI 10.0設(shè)計(jì)合成引物，試驗(yàn)所用引物均由華大基因合成（表1）。

表1 擴(kuò)增所需的引物及其序列Tab.1 Primer sequences and the amplified fragments

續(xù)表1

1.2.4基因片段的克隆和測序

以cDNA為模板，用引物ACL＿SP和ACL＿ASP擴(kuò)增出377bp產(chǎn)物命名為片段PCR－CLA；用引物CL2＿SP和CL＿ASP擴(kuò)增出354bp產(chǎn)物命名為片段PCR－CLB。將擴(kuò)增片段分別克隆到pGEMT Easy Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定并送華大基因進(jìn)行測序。

以含有基因片段PCR－CLA的重組質(zhì)粒為模板，用引物ACLSP／SP和ACLSP／ASP擴(kuò)增277bp CLA－f正 向 干 擾 片 段；用 引 物 ACLSP／SP－R 和ACLSP／ASP－R擴(kuò)增277bp CLA－r反向干擾片段。以含有基因片段PCR－CLB的重組質(zhì)粒為模板，用引物B5／SP和B5／ASP擴(kuò)增334bp CLB－f正向干擾片段；用引物B5／SP－R和B5／ASP－R擴(kuò)增334bp CLB－r反向干擾片段。將各干擾片段用T4DNA連接酶連接到pGEM－T Easy Vector構(gòu)建重組質(zhì)粒CLA－f、CLA－r、CLB－f、CLB－r。

1.2.5構(gòu)建RNAi載體

將CLA－r重組質(zhì)粒用Sac I／Spe I雙酶切，回收并連接到piRDG12相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成piRD＿CLA－r；將CLA－f重組質(zhì)粒和piRD＿CLA－r分別用 BamH I／Kpn I雙酶切，回收并連接，構(gòu)成中間載體piRD＿CLA。最后，將piRD＿CLA上Xba I／Sac I雙酶切片段連接到pBi35SG12相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成植物表達(dá)載體pBi35S＿CLA。

將CLB－r質(zhì)粒用Sac I／Spe I雙酶切，收并連接到piRDG12相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成piRD＿CLB－r；將CLA－f質(zhì)粒和piRD＿CLB－r分別用BamH I／Kpn I雙酶切，回收并連接，構(gòu)成piRD＿CLB。最后，將piRD＿CLB上Xba I／Sac I片段連接到pBi35SG12相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成植物表達(dá)載體pBi35S＿CLB。載體結(jié)構(gòu)簡圖如下：

1.2.6干擾載體遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

用電擊轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體pBi35S＿CLA和pBi35S＿CLB分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV1301，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化西方煙。

取生根的抗性植株葉片，用SDS法提取植物基因組DNA作模板，用檢測引物SP／pBi35S＿CLA和ASP／pBi35S＿CLA，SP／pBi35S＿CLB 和 ASP／pBi35S＿CLB，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR－CLA和PCR－CLB基因片段克隆及序列分析

從庫爾勒香梨枝條新葉提取的總RNA模板中逆轉(zhuǎn)錄模板合成cDNA鏈。用cDNA為模板，加入引物ACL＿SP／ACL＿ASP和CL2＿SP／CL＿ASP，經(jīng)PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的377和354bp產(chǎn)物（圖1）。

圖1 PCR－CLA和PCR－CLB片段克隆Fig.1 Clone of PCR－CLA and PCR－CLB

序列測序證明PCR－CLA和PCR－CLB分別是ACLSV CP和MP部分片段。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)PCRCLA與Genbank中登錄號為EU223295、AY669389、X99752、APCCOMS、APCCG、AJ243438、AB326225的其他ACLSV分離物核苷酸序列同源性為74.0%～88.9%；PCR－CLB與以上分離物核苷酸序列同源性為78.7%～92.4%（圖2）。

圖2 PCR－CLA和PCR－CLB的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of ACLSV from different isolates

圖3 CLA－f和CLA－r的克隆Fig.3 Clone of CLA－f and CLA－r

2.2.3構(gòu)建植物RNAi表達(dá)載體pBi35S＿CLA及重組子鑒定

將中間載體piRD＿CLA用Xba I／Sac I雙酶切，回收目的片段（小片段）并連接到pBi35SG12的Xba I／Sac I位點(diǎn)之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pBi35S＿CLA。

2.2 構(gòu)建RNAi載體pBi35S＿CLA及重組子鑒定

2.2.1克隆干擾片段CLA－f和CLA－r

以PCR－CLA 重 組 質(zhì) 粒 為 模 板，用 引 物ACLSP／SP和ACLSP／ASP擴(kuò)增277bp CLA－f正向干 擾 片 段；用 引 物 ACLSP／SP－R 和 ACLSP／ASP－R擴(kuò)增277bp CLA－r反向干擾片段（圖3）。

2.2.2構(gòu)建中間載體piRD＿CLA及重組子鑒定

將CLA－r重組子和piRDG12質(zhì)粒均Spe I／Sac I雙酶切，回收目的基因片段并連接，構(gòu)成質(zhì)粒piRD＿CLA－r。

將重組質(zhì)粒 CLA－f和 piRD＿CLA－r分別用BamH I／Kpn I雙酶切，回收目的片段并連接，構(gòu)成重組子piRD＿CLA－r－f（命名為piRD＿CLA）。重組子piRD＿CLA經(jīng)Xba I／Sac I雙酶切獲得與預(yù)期大小一致的857bp片段，說明質(zhì)粒piRD＿CLA構(gòu)建成功（圖4）。

圖4 piRD＿CLA重組子鑒定Fig.4 Identification of recombinant vector piRD＿CLA

重組質(zhì)粒pBi35S＿CLA，用BamH I／EcoICR I雙酶切和BamH I／EcoR I雙酶切2次鑒定，分別獲得與預(yù)期大小一致的851bp條帶（圖5a）和1122bp條帶（圖5b），說明RNAi表達(dá)載體pBi35S＿CLA構(gòu)建成功。

圖5 pBi35S＿CLA重組子鑒定Fig.5 Identification of recombinant vector pBi35S＿CLA

2.3 構(gòu)建RNAi載體pBi35S＿CLB及重組子鑒定

2.3.1克隆干擾片段CLB－f和CLB－r

以PCR－CLB重組質(zhì)粒為模板，用引物B5／SP和B5／ASP擴(kuò)增334bp CLB－f正向干擾片段；用引物B5／SP－R和B5／ASP－R擴(kuò)增334bp CLB－r反向干擾片段（圖6）。

2.3.2構(gòu)建中間載體piRD＿CLB及重組子鑒定

將CLB－r重組子進(jìn)行Spe I／Sac I雙酶切，回收小片段（目的基因片段），連接到piRDG12質(zhì)粒經(jīng)Spe I／Sac I位點(diǎn)之間，構(gòu)成質(zhì)粒piRD＿CLB－r。

將重組質(zhì)粒 CLB－f和 piRD＿CLB－r分別用BamH I／Kpn I雙酶切，回收目的片段并連接，構(gòu)成重組子piRD＿CLB－r－f（命名piRD＿CLB）。重組子piRD＿CLB經(jīng)Xba I／Sac I雙酶切獲得與預(yù)期大小一致的971bp片段，說明質(zhì)粒piRD＿CLB構(gòu)建成功（圖7）。

圖6 CLB－f和CLB－r克隆Fig.6 Clone of CLB－f and CLB－r

2.3.3構(gòu)建植物RNAi表達(dá)載體pBi35S＿CLB及重組子的鑒定

將中間載體piRD＿CLB分別用Xba I／Sac I雙酶切，回收目的片段（小片段）并連接到pBi35SG12的Xba I／Sac I位點(diǎn)之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pBi35S＿CLB。

圖7 piRD＿CLB重組子鑒定Fig.7 Identification of recombinant vector piRD＿CLB

質(zhì)粒pBi35S＿CLB用BamH I／EcoICR I雙酶切和BamH I／EcoR I雙酶切鑒定，獲得與預(yù)期大小一致的965bp條帶（圖8a）和1236bp條帶（圖8b），說明RNAi表達(dá)載體pBi35S＿CLB構(gòu)建成功。

圖8 pBi35S＿CLB重組子鑒定Fig.8 Identification of recombinant vector pBi35S＿CLB

2.4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301及鑒定

采用電擊轉(zhuǎn)化法將RNAi表達(dá)載體pBi35S＿CLA和pBi35S＿CLB轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV1301中。用引物 ACLSP／SP和 ACLSP／ASP檢測 GV1301＿pBi35S＿CLA，擴(kuò)增產(chǎn)物為270bp左右（圖9），與預(yù)期大 小 一 致；用 引 物 B5／SP 和 B5／ASP 檢 測GV1301＿pBi35S＿CLB，擴(kuò)增產(chǎn)物為340bp左右（圖10），與預(yù)期大小一致，說明2個載體均成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV1301。

圖9 PCR檢測GV1301＿pBi35S＿CLAFig.9 GV1301＿pBi35S＿CLA tested by PCR

圖10 PCR檢測GV1301＿pBi35S＿CLBFig.10 GV1301＿pBi35S＿CLB tested by PCR

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的檢測及鑒定

將RNAi表達(dá)載體pBi35S＿CLA和pBi35S＿CLB通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得轉(zhuǎn)基因西方煙。用SDS法提取轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA，然后進(jìn)行PCR檢測。

用引物SP／pBi35S＿CLA和 ASP／pBi35S＿CLA檢測47株pBi35S＿CLA抗性植株，成功擴(kuò)增出220 bp目的片段的有27株（圖11）；用引物SP／pBi35S＿CLB和 ASP／pBi35S＿CLB檢測39株pBi35S＿CLB抗性植株，成功擴(kuò)增出270bp目的片段的有24株（圖12）。

圖11 轉(zhuǎn)pBi35S＿CLA煙草DNA檢測Fig.11 Test transgenic plants of pBi35S＿CLA by PCR

3 討論

在新疆特殊的地理位置和氣候環(huán)境下，各種生物在長期的進(jìn)化過程中，遺傳物質(zhì)變化及差異性都較大。

根據(jù)對本研究中擴(kuò)增的序列分析比對發(fā)現(xiàn)：新疆庫爾勒香梨蘋果褪綠葉斑病毒的核苷酸序列與其他分離物存在非常大的差異。這些差異性主要表現(xiàn)在該病毒源于不同地域的分離物和源于不同寄主植物的分離物，如本研究中來源于香梨的PCR－CLA和PCR－CLB與來源于桃樹分離物（Genbank登陸號EU223295）［11］核苷酸同源性最低，分別為74%和78%；與來源于李樹分離物（AJ243438）核苷酸同源性最高，分別為88.9%和92.4%。PCR－CLA與同樣來自于新疆庫爾勒香梨分離物（AY669389）同源性也只有80.4%。這說明ACLSV病毒的遺傳變異性非常大，給檢測和研究該病毒帶來一定困難。

圖12 轉(zhuǎn)pBi35S＿CLB煙草DNA檢測Fig.12 Test transgenic plants of pBi35S＿CLB by PCR

利用RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的抗病性更具有特異性、穩(wěn)定性、可傳遞性和高效性。但是在設(shè)計(jì)RNAi載體時，如何選取干擾靶標(biāo)序列能更有效抑制病毒入侵，其中包括靶標(biāo)序列的長度，靶標(biāo)序列位于病毒基因組區(qū)段等，還有待進(jìn)一步深入研究了解。

本研究中，CLB干擾片段和CLA干擾片段分別位于MP基因和CP基因的高度保守區(qū)域內(nèi)，而ACLSV的MP蛋白也屬于基因沉默抑制蛋白中的一種，能抑制基因沉默信號的長距離運(yùn)輸［12］，希望通過干涉入侵ACLSV病毒的MP蛋白和CP蛋白的合成，來分析了解各病毒蛋白分子在病毒感染過程中所起的作用，所扮演的角色，并進(jìn)一步了解ACLSV的關(guān)鍵致病因子。同時，希望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育和繁殖高抗病的苗木資源。

目前，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，已成功獲得2個RNAi載體的轉(zhuǎn)基因煙草，從而為后期對各干擾載體的干涉效果評價試驗(yàn)奠定了材料基礎(chǔ)。

［1］劉福昌，王煥玉.蘋果潛隱病毒（Latent virus）研究Ⅱ、蘋果品種和矮生砧木潛隱病毒鑒定［J］.植物病理學(xué)報，1989，19（4）：193－197.

［2］洪霓，王國平.蘋果褪綠葉斑病毒生物學(xué)及生化特性研究［J］.植物病理學(xué)報，1999，29（1）：77－81.

［3］Rongrong Tan，Liping Wang，Ni Hong，et al.Enhanced efficiency of virus eradication following thermotherapy of shoot－tip cultures of pear［J］.Plant Cell Tiss Organ Cult，2010，101：229－235.

［4］蔡瑜，向本春，席德慧，等.蘋果褪綠葉斑病毒庫爾勒香梨分離物外殼蛋白基因的序列分析［J］.石河子大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，22（3）：197－199.

［5］馬書尚，阮小鳳，楊勇.蘋果褪綠葉斑病毒的ELISA檢測技術(shù)研究［J］.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，28（2）：27－30.

［6］Zheng Y Y，Wang G P，Hong N，et al.Partial mole cular characterization of Apple chlorotic leaf spot virus from peach and apple trees and prokaryotic expressionfor cp gene［J］.Acta Phytopathologica Sinica，2007，37（4）：356－361.

［7］王國平，洪霓.果樹病毒檢測與脫除技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，23（6）：685－691.

［8］Lindbo J A，Silvar Rosales L，Proebsting W M，et al.Induction of a highly specific antiviral state in transgenic plants：implications for regulation of gene expression and virus resistance［J］.Plant Cell，1993，5（12）：1749.

［9］Andrew J Hamilton，Stephen Brown，Han Yuanhai，et al.A transgene with repeated DNA causes high frequency，posttranscriptional suppression of ACC－oxidase gene expression in tomato［J］.Plant Journal，1998，15（6）：737－746.

［10］朱俊華，朱常香，溫孚江，等.正向和反向RNA重復(fù)介導(dǎo)的抗馬鈴薯Y病毒基因工程比較研究［J］.植物病理學(xué)報，2004，34（2）：133－140.

［11］Marini D B，Gibson P G，Scott S W.The complete nucleotide sequence of an isolate of apple chlorotic leaf spot virus from peach （Prunus persica（L.）Batch）［J］.Archives of Virology，2008，153：1003－1005.

［12］Hajime Yaegashi，Tsubasa Takahashi，Masamichi Isogai，et al.Apple chlorotic leaf spot virus 50kDa movement protein acts as a suppressor of systemic silencing without interfering with local silencing in Nicotiana benthamiana［J］.Journal of General Virology，2007，88：316－324.