徐檬，徐小琳，李春，2

（1石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院／新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003；2北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081）

微藻生物柴油是一種優(yōu)良的可再生新能源，對(duì)于解決人類面臨的能源短缺和全球變暖兩大危機(jī)具有潛在的重大戰(zhàn)略意義，微藻能源的產(chǎn)業(yè)化已成為世界各國(guó)研究與發(fā)展的重點(diǎn)［1］。然而，目前的富油藻種在含油率和生長(zhǎng)速率之間普遍存在著嚴(yán)重的矛盾［2］，同時(shí)，對(duì)環(huán)境條件變化敏感，耐受性差；細(xì)胞個(gè)體小，細(xì)胞采收及油脂提取不方便等問題。這些矛盾和問題導(dǎo)致了微藻能源成本高、生產(chǎn)效率低，阻礙了微藻能源產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展［3］。

荒漠微藻主要是指生長(zhǎng)在荒漠化土地上的藻類。作為先鋒拓殖生物，荒漠微藻生命力頑強(qiáng)，能夠在條件惡劣的環(huán)境下生長(zhǎng)、繁殖［4］。與傳統(tǒng)用于生產(chǎn)油脂的微藻相比，荒漠微藻環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，可以耐受較大的溫度變化、高鹽堿度和強(qiáng)光輻射，因此適合于低成本的大規(guī)模戶外培養(yǎng)?；哪⒃宓膽?yīng)用開發(fā)具有極大潛力，目前已經(jīng)涉及到沙漠治理、食品、紡織、化妝品和醫(yī)療保健品等方面，但還沒有將荒漠微藻用于開發(fā)生物能源的報(bào)道。因此，廣泛篩選具有富油能力的荒漠微藻，對(duì)微藻生物柴油應(yīng)用研究具有重要的意義。

本研究通過人工分離得到可進(jìn)行混養(yǎng)生長(zhǎng)的富油荒漠微藻，并對(duì)培養(yǎng)方式及培養(yǎng)基中的氮和磷對(duì)其生長(zhǎng)和油脂積累的影響進(jìn)行了研究，以期為富油荒漠微藻的進(jìn)一步研究及大規(guī)模培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品采集于新疆地區(qū)的戈壁、沙漠和鹽堿地。

土壤樣品經(jīng)研磨后，稱取10g溶于500mL無菌水中，紗布過濾4次以除去雜物，將過濾得到的澄清溶液以5%（V／V）的接種量接種到50mL BG11液體培養(yǎng)基中，在25℃、光照4500lx和光暗比（L∶D）12h∶12h的光照培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)15d，獲得混合藻液。將藻液梯度稀釋105至106倍，均勻涂布于含有1.3%瓊脂的固體BG11培養(yǎng)基表面，在上述培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)15d。挑取固體平板上的單藻落進(jìn)行顯微鏡觀察，純種微藻接種至BG11液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上；不純?cè)宸N繼續(xù)重復(fù)上述稀釋涂布過程，直至得到純種藻株。

試驗(yàn)用BG11培養(yǎng)基［5］進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

GXZ－380C智能光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）；UV2100紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)UNICO）；80i熒光數(shù)碼生物顯微鏡（日本 Nikon）；FD－1－50冷凍真空干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，購(gòu)于北京化工廠。

1.3 試驗(yàn)方法

所有試驗(yàn)除特殊說明之外，均在裝液量為300 mL的500mL三角燒瓶中進(jìn)行。

以培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液為種子液，調(diào)整其初始密度為OD670＝0.2，以10%（V／V）接種量接種后，置于溫度25℃、光照4500lx、光暗比（L∶D）12 h∶12h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)搖瓶3或4次。同時(shí)，定期采用顯微鏡進(jìn)行觀察以確定微藻是否正常生長(zhǎng)或是否存在雜菌污染現(xiàn)象。

1.3.1培養(yǎng)方式對(duì)微藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

取種子液，自養(yǎng)培養(yǎng)接種于BG11液體培養(yǎng)基，異養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)接種于含有10g／L葡萄糖的BG11液體培養(yǎng)基；自養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如前所述，異養(yǎng)培養(yǎng)組置于無光照的25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2混養(yǎng)氮濃度對(duì)微藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

取種子液，分別接種于氮濃度為50、100、200、400、800、1600mg／L的含有10g／L葡萄糖的BG11液體培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3混養(yǎng)磷濃度對(duì)微藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

取種子液，分別接種于磷濃度為2、4、8、16、32 mg／L的含有10g／L葡萄糖的BG11液體培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4氮磷比（mol∶mol）對(duì)微藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

以磷酸氫二鉀為磷源，固定硝酸鈉使氮濃度為200mg／L，取種子液，分別接種于氮磷比為17.1、34.2、68.3、136.7、273.3的含有10g／L葡萄糖的BG11液體培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 測(cè)量指標(biāo)及方法

1.4.1生物量

采用干重法，培養(yǎng)液于穩(wěn)定期第4天8000r／min下離心5min，收集微藻細(xì)胞，蒸餾水洗滌1次，冷凍干燥至恒重。

采用下式計(jì)算生物量：

1.4.2細(xì)胞密度

用無菌水將微藻溶液按濃度梯度稀釋，測(cè)定藻液在670nm處的吸光值（OD670），并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)微藻個(gè)數(shù)，建立微藻細(xì)胞密度與吸光度OD670的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程如下：

式（2）中：X為微藻的吸光值OD670，Y 為微藻細(xì)胞密度（×107個(gè)／mL），R2＝0.995。

1.4.3油脂的提取與測(cè)定

微藻細(xì)胞破碎采用酸熱法［6］，油脂提取采用氯仿－甲醇法［7］。用以下公式計(jì)算油脂含量：

2 結(jié)果與分析

2.1 富油荒漠微藻的篩選

經(jīng)過3次分離純化得到113株純種微藻，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定全為綠藻門，其中球藻屬43株，柵藻屬70株。在自養(yǎng)培養(yǎng)條件下，113株荒漠微藻的含油量在10%～24%，生物量產(chǎn)率在10mg／（L·d）～24 mg／（L·d），油脂產(chǎn)率在1.5mg／（L·d）～4.6 mg／（L·d）之間。選擇其中油脂產(chǎn)率較高的13株藻種進(jìn)行進(jìn)一步自養(yǎng)、混養(yǎng)培養(yǎng)研究，結(jié)果見表1。

由表1可知：藻株11在自養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)方式下油脂產(chǎn)率均高于其他藻株，故選擇11號(hào)藻株為目的藻株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。該藻株細(xì)胞為球狀，單細(xì)胞，細(xì)胞壁?。痪哂幸粋€(gè)明顯的細(xì)胞核。直徑5μm～8μm之間。生殖個(gè)體直徑較大，無性生殖產(chǎn)生似親孢子。根據(jù)《中國(guó)淡水藻類—系統(tǒng)、分類及生態(tài)》進(jìn)行檢索分類［8］，初步鑒定其為蛋白核小球藻 （Chlorella pyrenoidosa）。

表1 荒漠微藻生物量及油脂含量測(cè)定結(jié)果Tab.1 The biomass and lipid content of desert microalgae

2.2 培養(yǎng)方式對(duì)荒漠微藻C.pyrenoidosa生長(zhǎng)和油脂積累的影響

微藻根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)方式分為光能自養(yǎng)、化能異養(yǎng)2種，相應(yīng)地其培養(yǎng)方式可分為光能自養(yǎng)型、異養(yǎng)型和混養(yǎng)型3種，培養(yǎng)方式的不同對(duì)微藻油脂含量與組成有較大影響。研究考察荒漠微藻C.pyrenoidosa在3種不同培養(yǎng)方式下的生長(zhǎng)及油脂積累情況，結(jié)果如圖1所示。

興趣點(diǎn)，就是目標(biāo)要向主體本身的學(xué)習(xí)、生活興趣靠近。只有和興趣相近的目標(biāo)，才能激發(fā)主體更大的動(dòng)力，獲得更多的可能性。據(jù)調(diào)查，主體對(duì)目標(biāo)有興趣，那目標(biāo)達(dá)成的可能性比對(duì)目標(biāo)沒有興趣達(dá)成的可能性高兩倍以上。

圖1 不同培養(yǎng)方式對(duì)荒漠微藻C.pyrenoidosa的生長(zhǎng)及油脂積累的影響Fig.1 Effect of different cultivation methods on the growth and lipid accumulation of desert microalgae C.pyrenoidosa

由圖1a可知：荒漠微藻C.pyrenoidosa在異養(yǎng)和混養(yǎng)方式下的延滯期較短，而在自養(yǎng)方式下的延滯期較長(zhǎng)。在異養(yǎng)和混養(yǎng)方式下該藻可以較快的達(dá)到穩(wěn)定期，培養(yǎng)15d即可達(dá)到最大細(xì)胞密度，而在自養(yǎng)方式下該藻生長(zhǎng)緩慢，需要近60d才能達(dá)到穩(wěn)定期，且細(xì)胞密度較低。在混養(yǎng)方式下指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率最大，15d即可獲得最高的細(xì)胞密度3.5×107個(gè)／mL，而在異養(yǎng)和自養(yǎng)方式下細(xì)胞密度較低。

由圖1b可知：混養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)荒漠微藻C.pyrenoidosa的生物量產(chǎn)率是自養(yǎng)培養(yǎng)的5.3倍，油脂含量最高達(dá)30.0%，比自養(yǎng)培養(yǎng)增加了91.1%。異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)油脂含量比自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)增加了49.0%，但生物量產(chǎn)率有所降低。

微藻油脂產(chǎn)率由生物量和油脂含量共同決定，因此，盡管異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)荒漠微藻C.pyrenoidosa的含油量較高，但是低生物量導(dǎo)致其應(yīng)用價(jià)值較低。Tamarys等［9］研究也發(fā)現(xiàn)，在混養(yǎng)條件下普通小球C.vulgaris的生物量濃度為自養(yǎng)條件下的3.5倍。這是由于在自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，微藻細(xì)胞密度的增加致使培養(yǎng)核心區(qū)域的遮光效應(yīng)增大，光衰減現(xiàn)象嚴(yán)重，光合作用效率降低，導(dǎo)致微藻細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，生物量和油脂產(chǎn)率均較低。

異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，微藻可以利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，啟動(dòng)了不同的代謝途徑，使油脂含量提高，但可能由于光照對(duì)微藻的生長(zhǎng)起著重要作用，因此在黑暗環(huán)境中異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)和油脂的積累受到明顯抑制。

混養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，微藻一方面能利用光能和CO2進(jìn)行光合作用進(jìn)行自養(yǎng)代謝，另一方面又能以有機(jī)碳作為補(bǔ)充碳源和能源進(jìn)行異養(yǎng)代謝，因此，光照和有機(jī)碳源的聯(lián)合作用促進(jìn)了微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和油脂積累。故選擇混養(yǎng)培養(yǎng)方式進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.3 混養(yǎng)氮濃度對(duì)荒漠微藻C.pyrenoidosa生長(zhǎng)和油脂積累的影響

氮是影響微藻生長(zhǎng)及代謝最主要的因素之一，微藻對(duì)氮鹽的喜好和利用能力因種而異。氮濃度的變化對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量、組成具有顯著影響［10］。

表2 氮濃度對(duì)荒漠微藻C.pyrenoidosa生長(zhǎng)和油脂積累的影響Tab.2 Effect of nitrogen concentration on the growth and lipid accumulation of desert microalgae C.pyrenoidosa

由表2可知：當(dāng)?shù)獫舛仍?0～200mg／L時(shí)，荒漠微藻C.pyrenoidosa的油脂產(chǎn)率及生物量產(chǎn)率均隨著氮濃度的升高增加，但當(dāng)?shù)獫舛却笥?00mg／L時(shí)油脂產(chǎn)率及生物量產(chǎn)率隨著氮濃度升高而減少。油脂產(chǎn)率及生物量產(chǎn)率均在氮濃度為200mg／L時(shí)達(dá)到最大值，分別為46.3mg／（L·d）和154.2mg／（L·d）。油脂含量隨著氮濃度的升高而降低，在氮濃度為50mg／L達(dá)到最高32.5%。表明荒漠微藻C.pyrenoidosa在低氮條件下能大量積累油脂，與目前許多小球藻研究報(bào)道相一致。

Illman等［11］將5株小球藻培養(yǎng)在低氮條件下，除一株小球藻油脂含量并沒有顯著提高外，其余4株油脂含量均提高了約1倍。Arief等［12］研究也表明正常生長(zhǎng)的普通小球藻C.vulgaris在經(jīng)過一段時(shí)間的缺氮培養(yǎng)后，油脂含量也有所提高。一般氮源濃度增加時(shí)，蛋白質(zhì)含量提高，而油脂和碳水化合物的含量降低。油脂作為微藻細(xì)胞主要的儲(chǔ)能物質(zhì)，在適宜的生長(zhǎng)條件下并不會(huì)在胞內(nèi)大量積累油脂。氮缺乏可導(dǎo)致微藻蛋白質(zhì)含量降低，而碳水化合物或油脂含量升高。氮脅迫雖然可以大幅度提高微藻胞內(nèi)油脂的含量，但同時(shí)微藻的生長(zhǎng)也受到了限制，生物量較低，油脂產(chǎn)率因而并沒有得到大幅度的提高。氮過量會(huì)抑制微藻細(xì)胞生長(zhǎng)，這可能是由于營(yíng)養(yǎng)鹽濃度過高，會(huì)造成鹽度升高，引起細(xì)胞滲透壓變化。因此，荒漠微藻C.pyrenoidosa的最優(yōu)混養(yǎng)氮濃度為200mg／L。

2.4 混養(yǎng)磷濃度對(duì)荒漠微藻C.pyrenoidosa生長(zhǎng)和油脂積累的影響

磷也是微藻生長(zhǎng)所需的一種基本營(yíng)養(yǎng)元素。磷是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的重要元素，也是細(xì)胞膜和核酸的重要組成成分。磷在微藻細(xì)胞碳、氮代謝活動(dòng)中起著重要的作用。

本研究考察了不同磷濃度對(duì)荒漠微藻C.pyre－noidosa的生長(zhǎng)及油脂積累的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 磷濃度對(duì)荒漠微藻C.pyrenoidosa的生長(zhǎng)及油脂積累的影響Fig.2 Effect of phosphorus concentration on the growth and lipid accumulation of desert microalgae C.pyrenoidosa

由圖2可知：當(dāng)混養(yǎng)培養(yǎng)基中的磷濃度高于或低于4mg／L時(shí)，荒漠微藻C.pyrenoidosa生長(zhǎng)均受到磷濃度的限制，在磷濃度為4mg／L時(shí)，細(xì)胞密度可以達(dá)到最高4.3×107個(gè)／mL（圖2a），油脂產(chǎn)率及生物量產(chǎn)率也達(dá)到最高，分別為40.9mg／（L·d）及142.5mg／（L·d）（圖2b）。在低磷濃度時(shí)荒漠微藻C.pyrenoidosa油脂含量較高，隨著磷濃度增大油脂含量降低，當(dāng)磷濃度在2mg／（L·d）時(shí)，油脂含量最高可達(dá)32.2%，但生物量受磷濃度限制，造成綜合油脂產(chǎn)率不高。當(dāng)磷濃度在4～32mg／L范圍內(nèi)時(shí)，生物量產(chǎn)率隨磷濃度增大而降低。

其原因可能是由于磷缺乏會(huì)限制H＋－ATP酶的活性，不利于細(xì)胞內(nèi)ATP的合成，細(xì)胞代謝活性降低，從而嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長(zhǎng)［13］。高磷條件會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的代謝活性，提高光合作用效率，故具有較快的生長(zhǎng)速率和較大的生物量。但磷含量過高的條件下的生物量降低，這可能是由于在生長(zhǎng)后期，氮源被耗盡，N／P比例失調(diào)，不利于藻細(xì)胞的分裂。磷不僅參與碳水化合物在藻細(xì)胞不同細(xì)胞器之間的重新分配，還參與能量的代謝，如ATP［14］。磷脅迫條件下也能降低微藻蛋白質(zhì)的含量并增加油脂的含量，但其影響因種而異。有研究表明磷限制條件下，角毛藻、魯茲巴夫藻、柵藻的油脂含量增加。但也有微藻如微綠球藻、融合微藻和綠色鞭毛藻中，磷限制反而導(dǎo)致油脂含量降低［15］。因此，荒漠微藻C.pyrenoidosa的最優(yōu)混養(yǎng)磷濃度為4mg／L。

2.5 氮磷比（mol／mol）對(duì)荒漠微藻 C.pyrenoidosa生長(zhǎng)及油脂積累的影響

有研究［16］表明，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝特性不僅與環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)鹽濃度有關(guān)，而且與N／P比值有很大關(guān)系。本研究考察了不同N／P比（mol∶mol）對(duì)荒漠微藻C.pyrenoidosa細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累的影響，結(jié)果見圖3所示。

圖3 氮磷比對(duì)荒漠微藻C.pyrenoidosa生長(zhǎng)和油脂積累的影響Fig.3 Effect of N／P on biomass and lipid accumulation of desert microalgae C.pyrenoidosa

由圖3可見：在N／P＝136.7時(shí)可獲得獲得最大生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率；隨著N／P的升高，細(xì)胞的油脂含量持續(xù)升高，N／P值從15增加到280時(shí)，油脂含量從占干重的23.4%升至32.2%左右。N／P在15～35時(shí)，油脂含量增加最快；而在N／P＞35時(shí)增加含氮量油脂含量增加趨勢(shì)減緩。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，在N／P＜136.7時(shí)，氮源是藻細(xì)胞生長(zhǎng)的限制因素，氮源的增加可明顯促進(jìn)藻的生長(zhǎng)。但當(dāng)N／P＞136.7時(shí)達(dá)到氮飽和狀態(tài)，細(xì)胞的生長(zhǎng)不再取決于氮源，而是取決于磷濃度。

Craggs［17］的研究表明微藻的化學(xué)組成為C∶N∶P＝106∶16∶1（原子比值），故后來的學(xué)者多以16∶1作為微藻生長(zhǎng)的最適氮磷比例，但其忽略了微藻在不同的生長(zhǎng)過程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的需求各不同。從荒漠微藻C.pyrenoidosa的生長(zhǎng)速率、生物量和油脂積累量等多方面考慮，本研究結(jié)果表明：該藻混養(yǎng)生長(zhǎng)的適宜N／P約為137，要遠(yuǎn)高于一般藻類最適生長(zhǎng)N／P標(biāo)準(zhǔn)16?？赡苁窃谖⒃暹M(jìn)行混養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增長(zhǎng)迅速，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)大量合成，需要消耗大量的氮磷。因此，綜合考慮生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率確定最優(yōu)N／P為136.7。

3 結(jié)論

（1）從新疆地區(qū)荒漠化土樣中篩選出一株高產(chǎn)油荒漠蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），在自養(yǎng)條件下其生物量產(chǎn)率及油脂產(chǎn)率分別可達(dá)29.0 mg／（L·d）和4.6mg／（L·d）。

（2）荒漠微藻C.pyrenoidosa的最適培養(yǎng)方式為混養(yǎng)培養(yǎng)。

（3）氮磷限制均有利于荒漠微藻C.pyrenoidosa總脂的積累，但不利于其生長(zhǎng)，綜合考慮油脂產(chǎn)率，荒漠微藻C.pyrenoidosa混養(yǎng)最優(yōu)氮濃度為200mg／L；最優(yōu)磷濃度為4mg／L；最優(yōu)氮磷比為136.7，此時(shí)生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率分別為優(yōu)化前的5.3倍和10.1倍。

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