郭幻，姚俊，蔡珉敏，王靜偉

（北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院環(huán)境工程系／國(guó)家環(huán)境與能源國(guó)際科技合作基地，北京100083）

苯系化合物是石油烴中易揮發(fā)的一類(lèi)單環(huán)芳香烴化合物，簡(jiǎn)稱BTEX，廣泛應(yīng)用于石油、化工、農(nóng)藥、紡織、造紙、油漆、制鞋等生產(chǎn)過(guò)程，具有強(qiáng)致癌性，已被許多國(guó)家列為優(yōu)先控制的污染物［1］。

BTEX污染的治理技術(shù)按照機(jī)理不同可分為物理法、化學(xué)法和生物法，其中，生物降解具有能耗低、操作簡(jiǎn)單、處理效果好等優(yōu)點(diǎn)，是這類(lèi)污染物的主要處理技術(shù)之一。Alexander和 Bordelon研究［2－3］表明，在微生物降解多環(huán)芳烴和煤焦油的過(guò)程中，毒性較低的物質(zhì)被降解后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物毒性反而增加，且由于多種代謝物之間復(fù)雜的相互作用，這些污染物降解之后的底物甚至具有更強(qiáng)的致癌性。因此，在BTEX生物降解過(guò)程中，除了監(jiān)測(cè)其量的去除，還必須對(duì)不同降解程度混合物的毒性進(jìn)行研究。

細(xì)胞在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，有一部分能量會(huì)以熱的形式散發(fā)出來(lái)，應(yīng)用微量熱技術(shù)可以監(jiān)測(cè)這種能量的變化，獲得每個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的熱輸出動(dòng)態(tài)曲線。通過(guò)研究細(xì)胞在有毒物質(zhì)存在時(shí)熱輸出動(dòng)態(tài)曲線的變化，可以檢測(cè)有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響。這種技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確、快捷、原位、可提供實(shí)時(shí)的定量數(shù)據(jù)、直觀性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于研究重金屬、殺蟲(chóng)劑對(duì)生物的毒性［4－5］。

枯草芽孢桿菌為廣泛分布于環(huán)境的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是研究環(huán)境中污染物毒性的代表性微生物［6－7］。因此，本文應(yīng)用微量熱技術(shù)探究不同生物降解程度下BTEX混合物對(duì)該菌代謝放熱速率的影響，從能量代謝角度分析生物降解技術(shù)降低BTEX毒性的有效性，為該技術(shù)實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

苯、甲苯、乙苯、二甲苯為分析純級(jí)。

毒性評(píng)價(jià)使用LB液體培養(yǎng)基，成分為：10.0 g／L 蛋白胨，5.0g／L 酵母膏，10.0g／L NaCl，1000 mL去離子水。

菌株降解性能評(píng)價(jià)使用液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，成分為：1.0g／L NaCl，0.7g／L MgSO4·7H2O，1.0 g／L NH4Cl，0.7g／L KCl，2.0g／L KH2PO4，3.0 g／L Na2HPO4，0.02mg／L CaCl2，0.5mg／L FeCl3·6H2O，0.005mg／L CuSO4，0.005mg／L MnCl2·4H2O，0.1mg／L ZnSO4·7H2O，1000mL去離子水。所用培養(yǎng)基于121oC，0.1MPa下滅菌30min。

1.2 BTEX降解菌的分離與鑒定

按照文獻(xiàn)［8］中富集和分離石油烴降解菌的方法，從天津大港油田的石油污染土壤中篩選出1株BTEX降解菌。降解菌DNA的提取和純化采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒（V 2.2，上海申能博彩生物科技有限公司），選用細(xì)菌通用引物Uni－27F和 Uni－1492R［9］對(duì)16SrRNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物合成由寶生物工程有限公司完成。PCR產(chǎn)物測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成，將測(cè)序結(jié)果同GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性比較分析，選取1400bp左右長(zhǎng)度進(jìn)行對(duì)比（CLUSTAL W），采用鄰位連接（neighbor－joining）法進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析（MEGA 4），確定菌株的種屬。

1.3 菌株的生理生化分析

其生理生化實(shí)驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

1.4 菌液的制備

將BTEX降解菌ustb－1和枯草芽孢桿菌均接種至LB液體培養(yǎng)基中，待菌株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，取菌液離心（8900r／min，10min），將收集的菌體用滅菌后的去離子水清洗3次，然后溶解到液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，使菌液的OD600＝0.5。2種菌株的菌液分別用于研究BTEX降解的特性和降解前后毒性的變化。

1.5 菌株ustb－1降解BTEX的特性

在300mL錐形瓶中加入100mL液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和1mL 1.4中制備的BTEX降解菌ustb－1的菌液，再分別加入100μL苯、50μL甲苯、10μL乙苯、10μL二甲苯，錐形瓶瓶口使用丁基橡膠塞密封，并用鋁冒將膠塞固定，以防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中苯系物的揮發(fā)。錐形瓶放置在搖床中，28℃，180r／min恒溫培養(yǎng)96h，每隔12h取樣測(cè)量菌液濃度，每隔24 h取樣測(cè)量錐形瓶中苯系物的濃度。

BTEX混合物的總降解率的計(jì)算參照文獻(xiàn)［1］。

1.6 BTEX混合物的毒性研究

采用美國(guó)TA儀器公司的TAM III型微量量熱儀研究不同降解程度BTEX混合物對(duì)枯草芽孢桿菌代謝放熱的影響，該儀器靈敏度為10nW。

將滅菌后的2mL液體LB培養(yǎng)基加入到滅菌后的4.5mL不銹鋼安培瓶中，再加入20μL 1.3中制備的枯草芽孢桿菌菌液待用。將經(jīng)過(guò)菌株ustb－1降解后的BTEX混合物（每24h取一次樣）經(jīng)0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后，取200μL分別加入到裝有枯草芽孢桿菌的安培瓶中。安培瓶中含有枯草芽孢桿菌菌液而不添加降解后的BTEX混合物為空白。將安培瓶放置在微量量熱計(jì)的監(jiān)測(cè)位置，控制儀器溫度為28oC，平衡后儀器自動(dòng)記錄枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)周期的熱輸出動(dòng)態(tài)曲線。

枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中的總放熱量（Qtotal，J）通過(guò)對(duì)熱輸出動(dòng)態(tài)曲線積分得到。微生物在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的熱量輸出與時(shí)間的關(guān)系可由公式（1）表示，即

式（1）中pt是微生物在對(duì)數(shù)期t時(shí)刻的熱輸出，p0是微生物在對(duì)數(shù)期開(kāi)始時(shí)的熱輸出。

比生長(zhǎng)速率（μ，h－1）可按式（1）對(duì)熱輸出動(dòng)態(tài)曲線中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期某一時(shí)刻t的熱輸出值對(duì)數(shù)lnpt和時(shí)間t進(jìn)行線性擬合得到。微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的最大熱輸出pmax（μW）和出現(xiàn)最大熱輸出的時(shí)刻tmax（min）可從熱輸出動(dòng)態(tài)曲線中直接獲得。

BTEX混合物對(duì)枯草芽孢桿菌比生長(zhǎng)速率μ的抑制率（I）可由式（2）計(jì)算得到

式（2）中，μ0和μc分別為枯草芽孢桿菌在空白組和BTEX混合物存在時(shí)的比生長(zhǎng)速率。

1.7 分析方法

（1）采用文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，用島津公司GC－MS（QP2010SE）進(jìn)行苯系物的定量，色譜柱為RXI－5MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；GC／MS參數(shù)設(shè)置如下：柱溫箱40oC，進(jìn)樣口290oC，分流比20／1，離子源200oC，接口230oC；升溫程序?yàn)椋?0oC，2min；40～70oC，25oC／min；70～80oC，2oC／min；80～250oC，25oC／min。

（2）菌液濃度（OD600）測(cè)量使用島津公司紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV－1800）。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTEX降解菌的鑒定

以天津大港油田被原油污染的土壤為菌源，經(jīng)過(guò)富集篩選得到1株BTEX降解菌，編號(hào)為ustb－1（Genbank登錄號(hào)是JN235141）。菌株ustb－1革蘭氏染色、孢子產(chǎn)生、過(guò)氧化氫酶、硝酸鹽還原、H2S、檸檬酸鹽利用、接觸酶等實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，氧化酶、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、甲基紅、熒光色素等實(shí)驗(yàn)為陰性。該菌株菌落形態(tài)為圓形，乳黃色，半透明，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，在LB液體培養(yǎng)基中的最適生長(zhǎng)溫度為28oC。

菌株ustb－1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示。

圖1顯示：該菌與模式菌株Rhodococcus DSM 43066T（X79289）的相似度為100%，可以推斷菌株ustb－1屬于Rhodococcus屬。

圖1 菌株ustb－1與Rhodococcus sp中典型菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖Fig.1 Neighbor－Joining phylogenetic trees based on 16SrRNA gene sequences of strain ustb－1 and other closely related strains

2.2 Rhodococcus sp.ustb－1對(duì) BTEX的降解特性

BTEX混合物降解過(guò)程中總濃度變化和降解菌生長(zhǎng)情況如圖2所示。

圖2 BTEX降解過(guò)程中總濃度變化及降解菌生長(zhǎng)情況Fig.2 BTEX compounds and biomass concentrations in aqueous phase during biodegradation

圖2顯示：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的24h內(nèi)BTEX混合物濃度變化不大，總的降解效率較低，這是因?yàn)榇藭r(shí)降解菌Rhodococcus sp.ustb－1處于對(duì)BTEX的適應(yīng)期，其生長(zhǎng)緩慢，活性較低且數(shù)量增加緩慢。24h后，Rhodococcus sp.ustb－1生長(zhǎng)增速，進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，BTEX濃度迅速降低，降解程度明顯增加，至48、72、96h時(shí)BTEX混合物的總降解效率分別達(dá)42.61%、79.63%、99.63%。

在BTEX 總濃度達(dá)1432.88mg／L，即接近BTEX在水中的飽和溶解度時(shí)，Rhodococcus sp.ustb－1仍可以高效降解BTEX類(lèi)物質(zhì)。生物降解技術(shù)去除揮發(fā)性有機(jī)污染物的效果是由這類(lèi)污染物的毒性決定的，一般情況下生物降解的周期較長(zhǎng)，并且要求底物的濃度不能太高。但是Rhodococcus sp.ustb－1在BTEX幾近水體飽和的情況下，依然有很高的活性，在96h內(nèi)對(duì)其降解程度達(dá)到99.63%，這表明其具有高效降解水體中BTEX類(lèi)污染物的能力。

2.3 不同降解程度的BTEX混合物對(duì)枯草芽孢桿菌代謝放熱的影響

在不同降解程度的BTEX混合物存在時(shí)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)周期的熱輸出動(dòng)態(tài)曲線如圖3所示。

圖3 枯草芽孢桿菌在不同降解程度BTEX混合物存在時(shí)的生長(zhǎng)代謝熱輸出動(dòng)態(tài)曲線Fig.3 The power－time curves of B.Subtilis growth at different degradation extent of BTEX compounds in LB medium

圖3顯示：微生物生長(zhǎng)的適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。與空白比較可知，不同降解程度的BTEX混合物對(duì)微生物的生長(zhǎng)有明顯的抑制，但是隨著降解時(shí)間的增加，BTEX混合物對(duì)微生物的抑制作用明顯降低。

為了定量分析不同降解程度BTEX混合物的毒性，運(yùn)用軟件Origin 8.0計(jì)算出每一條熱輸出動(dòng)態(tài)曲線所對(duì)應(yīng)的μ、Qtotal、pmax和tmax，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知：μ隨著B(niǎo)TEX濃度降低而增加，這與文獻(xiàn)［11］的研究結(jié)果一致。這是因?yàn)锽TEX混合物對(duì)微生物的毒性作用機(jī)制包括改變微生物細(xì)胞膜的滲透性和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使功能蛋白失活，降低微生物的代謝活性。μ隨著降解程度的加強(qiáng)而增加說(shuō)明降解后的BTEX混合物對(duì)微生物的毒性降低。

Qtotal隨著降解程度的增加而增加也說(shuō)明生物降解能夠有效降低BTEX混合物的毒性。但是，在降解96h后的BTEX混合物存在時(shí)，微生物的Qtotal為10.52J，大于空白的Qtotal（9.56J）。該結(jié)果與文獻(xiàn)［12－13］的結(jié)果一致，這是因?yàn)?6h后，99.63%的BTEX被除去，在低濃度的BTEX混合物存在下，微生物細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的適當(dāng)改變，適應(yīng)了這種壓力，從而具有更高的活性，因此生長(zhǎng)過(guò)程中將釋放更多的熱量。此外，pmax隨著降解時(shí)間的增加而增加，tmax隨著降解時(shí)間的增加而減少，這些參數(shù)的變化趨勢(shì)都表明隨著降解程度的增加，BTEX混合物對(duì)微生物的毒性逐漸降低，同時(shí)由圖3可知，以枯草芽孢桿菌為目標(biāo)微生物，利用微量熱技術(shù)監(jiān)測(cè)有機(jī)污染物生物降解過(guò)程中的毒性具有良好的應(yīng)用前景。

2.4 Rhodococcus sp.ustb－1 的降解作用降低BTEX毒性的有效性

不同降解程度的BTEX混合物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制率見(jiàn)表1。

表1 枯草芽孢桿菌在28℃下生長(zhǎng)代謝放熱參數(shù)Tab.1 Calorimetric parameters of B.subtilis growth obtained from microcalorimetry at 28℃

由表1可知：降解開(kāi)始24h時(shí)為84.70%，48h為75.03%，72h為45.72%，96h為17.03%。

抑制率與降解率的關(guān)系如圖4所示。

圖4顯示：BTEX對(duì)微生物的毒性隨著降解程度的增加而降低。但降解率從8.14%增至42.61%時(shí)，抑制率從84.70%降低到75.03%，并沒(méi)有發(fā)生相同程度的降低，而從48h之后，隨著降解程度的增加，抑制率才開(kāi)始明顯降低。這是因?yàn)樯锝到饩哂醒舆t性，在降解過(guò)程開(kāi)始時(shí)，雖然底物被去除，但是降解過(guò)程中間產(chǎn)物也具有毒性，所以抑制率并沒(méi)有明顯的下降，而是隨著降解時(shí)間的增加，降解程度增強(qiáng)，部分中間產(chǎn)物也被降解，抑制率才出現(xiàn)明顯的下降。

經(jīng)過(guò) Rhodococcus sp.ustb－1 降 解 96h 后，99.63%的BTEX被除去，但是，降解之后的底物對(duì)枯草芽孢桿菌仍有17.03%的抑制率。在Nunes－Halldorson等［14］的研究中，甲苯被微生物完全降解之后，其代謝產(chǎn)物依然能造成網(wǎng)紋水蚤24%的死亡率，雖然較降解前33%的死亡率有所下降，但依然有明顯的毒性存在。這可能是由于生物降解過(guò)程中有毒的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的存在導(dǎo)致的結(jié)果。例如，鄰苯二酚是苯系物生物降解過(guò)程的中間產(chǎn)物，已經(jīng)有研究表明其對(duì)微生物的毒性比苯系物大。

圖4 BTEX混合物降解程度與其毒性之間的關(guān)系Fig.4 The relation of degradation extent and toxicity of BTEX compound

3 結(jié)論

（1）從天津大港油田石油烴污染的土壤中，篩選出一株能高效降解BTEX的菌株ustb－1，經(jīng)鑒定為Rhodococcus屬。

（2）BTEX 初 始 濃 度 為 1432.88mg／L 時(shí)，Rhodococcus sp.ustb－1在96h內(nèi)對(duì)其降解程度達(dá)到99.63%；初始濃度為1432.88mg／L的 BTEX混合物經(jīng)Rhodococcus sp.ustb－1降解96h之后，對(duì)枯草芽孢桿菌比生長(zhǎng)速率的抑制率從84.70%降低到17.03%，有效降低了BTEX混合物的毒性。

（3）99.63%的BTEX被降解后對(duì)枯草芽孢桿菌比生長(zhǎng)速率依然有明顯的抑制，需要進(jìn)一步針對(duì)生物降解之后殘余毒性存在的原因進(jìn)行研究。

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