姚秀娟 李 艷 呂 喆 袁慧慧 賈軍會 趙文明 安云慶 王 煒* 黃克武 孫 英

目前，我國約有1500～2000萬人罹患哮喘，哮喘是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的慢性疾病。隨著社會工業(yè)化、城市現(xiàn)代化、環(huán)境清潔化的發(fā)展，近年來哮喘發(fā)病率有明顯增加的趨勢[1]。該病作為一種慢性進(jìn)行性疾病不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且增加了家庭和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，哮喘發(fā)生機(jī)制及其防治研究成為目前迫切需要解決的問題。

哮喘發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，動物模型是研究哮喘發(fā)病機(jī)制、進(jìn)行藥物研發(fā)的主要工具。其中將卵清蛋白(ovalbumin，OVA)經(jīng)腹腔或皮下多次致敏小鼠，霧化吸入OVA誘導(dǎo)哮喘的方法較為常見，該方法可引起小鼠氣道高反應(yīng)性、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、氣道重塑等哮喘病理學(xué)改變，同時也是進(jìn)行免疫學(xué)機(jī)制研究的優(yōu)選模型。然而，僅以肺組織存在嗜酸性粒細(xì)胞浸潤來判斷哮喘模型建立的成功與否仍存在較大爭議，因此限制了該類小鼠哮喘模型在國內(nèi)的廣泛應(yīng)用[2]。本實驗采用滴鼻法成功建立了急性和亞急性小鼠哮喘模型，并對采用不同劑量OVA滴鼻誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生不同程度支氣管哮喘癥狀，并對呈現(xiàn)氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑等主要特征進(jìn)行了評估，為進(jìn)一步探討哮喘的發(fā)生機(jī)制和藥物篩選奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

選用6～8周齡BALB/c雌性小鼠，均為無特定病原體(SPF)級小鼠，購于北京維通利華實驗動物有限責(zé)任公司。OVA、氫氧化鋁[Al(OH)3]凝膠，均購自美國Sigma公司。紅細(xì)胞裂解液、剛果紅染液購自北京Solarbio公司；伊紅(HE)染液購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；馬松染液購自南京建成科技有限公司；過碘酸雪夫氏(PAS)染液購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。FlexiVent動物肺功能測量儀(加拿大)；Eppendorf離心機(jī)(德國)。

1.2 方法

1.2.1 急性期和亞急性期支氣管哮喘模型小鼠的制備

取6～8周齡BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分成兩組：OVA組，生理鹽水(NS)組。OVA組每只小鼠于0 d、12 d腹腔注射100 μg OVA致敏；18～23 d，分別采用不同劑量OVA(25 μg、50 μg、100 μg)溶于50 μl生理鹽水中連續(xù)滴鼻激發(fā)急性和亞急性哮喘模型小鼠。NS組每只小鼠于0 d、12 d腹腔注射100 μl生理鹽水致敏；18～23 d，采用50 μl生理鹽水連續(xù)滴鼻激發(fā)作為對照組。

1.2.2 小鼠肺力學(xué)參數(shù)及氣道反應(yīng)性的測量

實驗在0 d、20 d、24 d按80 mg/kg體重腹腔注射苯巴比妥鈉將小鼠麻醉，行氣管切開插管并與動物肺功能測量儀相連接后，以含量為21%氧氣、呼吸頻率為150次/min、潮氣量10 ml/kg 、呼氣末正壓(PEEP)為2 cm H2O狀態(tài)下進(jìn)行機(jī)械通氣，腹腔注射0.05 ml琥珀酸膽鹼(9 mg/ml)使小鼠處于肌松狀態(tài)。當(dāng)小鼠呼吸平穩(wěn)后測量單腔模型和常態(tài)模型呼吸功能參數(shù)，完成測量后利用FlexiVent霧化器以生理鹽水和1 mg/ml、1.5 mg/ml、3 mg/ml、6 mg/ml、12 mg/ml呈遞增濃度的乙酰甲膽堿(Mch)溶液霧化原位激發(fā)10 s，1 min后測定肺功能參數(shù)，分別得到氣道阻力(Raw)、肺組織阻力(G)等的劑量對應(yīng)數(shù)值。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞計數(shù)

各組小鼠分別在0 d、20 d、24 d，肺功能測定結(jié)束后，即刻用氣管插管分3次注入預(yù)冷無菌PBS灌洗液(0.8 ml/次)；收集灌洗液以2000 rpm離心10 min，細(xì)胞沉淀經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后重懸于1 ml PBS中，取10 μl計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，另取100 μl細(xì)胞懸液涂片，干燥后經(jīng)HE染色和剛果紅染色后計數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞百分比(至少計數(shù)300個細(xì)胞)。

1.2.4 小鼠肺組織標(biāo)本的采集和病理學(xué)檢測

各組小鼠分別在0 d、20 d、24 d，收集肺泡灌洗液后，左肺用10%福爾馬林溶液4 ℃固定過夜，常規(guī)石蠟包埋切片(厚度約為5 μm)。分別進(jìn)行HE染色、剛果紅染色、PAS染色和馬松染色，觀察炎性細(xì)胞浸潤，特別是嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，黏液分泌和膠原沉積等氣道重塑指標(biāo)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用Prism 5.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，兩樣本均數(shù)之間采用Bonferroni's Multiple Comparison Test法進(jìn)兩兩比較，P＜0.05為存在統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量OVA誘導(dǎo)建立急性和亞急性哮喘模型小鼠肺功能參數(shù)

實驗20 d急性期，24 d亞急性期。乙酰膽堿(Mch)為3 mg/ml時，100 μg OVA激發(fā)組與50μg OVA激發(fā)組小鼠氣道阻力、肺組織阻力、明顯高于NS對照組；25 μg OVA激發(fā)組小鼠與NS對照組比較，氣道阻力、肺組織阻力無顯著性差異(如圖1所示)。

圖1 肺功能檢測

2.2 不同劑量OVA誘導(dǎo)建立急性和亞急性哮喘模型小鼠肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞百分比

實驗急性期(20 d)、亞急性期(24 d)，100 μg OVA激發(fā)組與50 μg OVA激發(fā)組小鼠肺泡灌洗液中計細(xì)胞總數(shù)較NS組顯著增加，嗜酸性粒細(xì)胞所占比例明顯增加，25 μg OVA激發(fā)組其細(xì)胞總數(shù)有少量增加，嗜酸性粒細(xì)胞亦較少(如圖2所示)。

圖2 肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞百分比

注：在20 d、24 d時，(圖A)50 μg和100 μg OVA激發(fā)組小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)明顯高于生理鹽水對照組和25 μg OVA激發(fā)組(每組n=5)。(圖B)50μg和100μg OVA激發(fā)組小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯高于生理鹽水對照組和25μg OVA激發(fā)組(每組n=5)。*：P＜0.05, **：P＜0.01, ***：P＜0.001

2.3 不同劑量OVA誘導(dǎo)建立急性和亞急性小鼠哮喘模型病理學(xué)改變

2.3.1 炎性改變

肺組織石蠟切片經(jīng)HE染色后見，100 μg OVA與50 μg OVA激發(fā)組小鼠肺泡、管腔、管壁及伴行動脈周圍均有大量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜皺襞增多、延長，管腔內(nèi)存有大量黏液性痰栓，25 μg OVA激發(fā)組小鼠支氣管管壁周圍有少量炎性細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)未見黏性痰栓存在(如圖3所示)。

圖3 行HE染色，生理鹽水組(A,E)，25 μg (B,F)，50 μg(C,G)和100 μg OVA激發(fā)組(D,H)

2.3.2 嗜酸粒細(xì)胞浸潤的觀察

肺組織石蠟切片經(jīng)剛果紅染色如圖4所示，100 μg OVA與50 μg OVA激發(fā)組小鼠管壁及伴行動脈周圍較NS組有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，25 μg OVA激發(fā)組小鼠管壁周圍亦有少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。

圖4 行剛果紅染色，生理鹽水組(A,E)，25 μg(B,F)，50 μg(C,G)和100 μg OVA激發(fā)組(D,H)

2.3.3 膠原纖維沉積的檢測

肺組織石蠟切片馬松染色如圖5所示，100 μg OVA與50 μg OVA激發(fā)組小鼠支氣管管壁及其伴行動脈周圍存在明顯的膠原纖維沉積，25 μg OVA激發(fā)組小鼠與NS組對比，管壁及其血管周圍膠原纖維沉積無明顯增加。

圖5 行馬松染色，生理鹽水組(A,E)，25 μg(B,F)，50 μg(C,G)和100 μg OVA激發(fā)組(D,H)

2.3.4 氣道粘液分泌的測定

肺組織石蠟切片經(jīng)PAS粘多糖染色顯示：100 μg OVA與50 μg OVA激發(fā)組小鼠較NS組氣道內(nèi)有大量粘液分泌，上皮細(xì)胞呈杯狀細(xì)胞樣增生，粘蛋白染色成陽性反應(yīng)。25 μg OVA激發(fā)組小鼠氣道上皮細(xì)胞內(nèi)也可見有少量粘液蛋白(如圖6所示)。

圖6 行PAS染色，生理鹽水組(A,E)，25 μg (B,F)，50 μg(C,G)和100 μg OVA激發(fā)組(D,H)

3 討論

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，其病理生理特征涉及氣道高反應(yīng)性和氣道重塑。Hayashi等[3]發(fā)現(xiàn)，在OVA誘發(fā)成熟雌性、雄性BALB/c小鼠的遲發(fā)性氣道炎癥中，雄性BALB/c小鼠其嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤的支氣管-細(xì)支氣管炎沒有雌性 BALB/c小鼠嚴(yán)重，而且支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)也較雌性小鼠少。因此，在本實驗中選用了SPF級BALB/c雌性小鼠，以便能更好地模擬哮喘的發(fā)病過程。

在過去的哮喘模型建立中，主要以肺組織是否存在明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤來判斷哮喘模型建立是否成功。隨著無氣道高反應(yīng)性的嗜酸性粒細(xì)胞性支氣管炎診斷的提出[4], BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比的增加并不能完全判斷為哮喘模型，氣道反應(yīng)性的增高是判斷哮喘模型成功建立的重要指標(biāo)。通常認(rèn)為有創(chuàng)的肺功能檢測是氣道高反應(yīng)性的金指標(biāo)，適用于阻塞性和限制性肺部疾病的檢查[5]。有創(chuàng)小鼠肺功能檢查遵循呼吸生理學(xué)和解剖學(xué)的原理，敏感性特異性較高，能夠確定氣道收縮的強(qiáng)度與具體部位，并可避免上氣道阻力帶來的誤差[6-9]。

本實驗使用小動物肺功能測量儀，在小鼠哮喘模型急性期和亞急性期，利用FlexiVent霧化器以生理鹽水和遞增濃度的乙酰甲膽堿溶液霧化原位激發(fā)后測定肺力學(xué)參數(shù)，分別得到小鼠氣道阻力(Raw)、肺組織阻力(G)的數(shù)值。檢測發(fā)現(xiàn)，50 μg和100 μg OVA激發(fā)組小鼠氣道阻力(Raw)、肺組織阻力(G)在乙酰膽堿(Mch)濃度為3 mg/ml激發(fā)時明顯高于生理鹽水組，兩組比較差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。25 μg OVA激發(fā)組小鼠氣道阻力(Raw)、肺組織阻力(G)較生理鹽水組增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，實驗結(jié)果表明50 μg應(yīng)為首選誘導(dǎo)劑量，不僅可以誘導(dǎo)較多嗜酸粒細(xì)胞浸潤，亦可誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性和一定程度的氣道重塑。

方法不一的小鼠哮喘模型構(gòu)建是為了進(jìn)一步了解過敏性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的病理機(jī)制[10-12]。在國內(nèi)外小鼠哮喘模型的建立中，霧化激發(fā)的方法較為常見[13-16]。此外，有研究使用OVA以外的致敏原制備出哮喘模型以便更好地模擬人類哮喘發(fā)病機(jī)制[17-20]。本實驗采用25 μg、50 μg和100 μg OVA滴鼻，成功制備急性期和亞急性期小鼠哮喘模型，不同劑量的OVA滴鼻可誘導(dǎo)不同程度支氣管哮喘模型。此方法操作方便，無需使用特殊裝置，不僅可以縮短實驗耗時，節(jié)約成本，更能夠避免因OVA霧化揮發(fā)而對實驗操作人員所造成的損傷。

4 結(jié)語

理想的哮喘模型應(yīng)具備氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等特征。本實驗采用OVA滴鼻法成功建立了急性和亞急性小鼠哮喘模型，通過有創(chuàng)肺功能和炎性反應(yīng)的檢測，確認(rèn)了該模型的可靠性及首選過敏原劑量，為進(jìn)一步研究哮喘的發(fā)生機(jī)制和藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。

[1]鐘南山.我國支氣管哮喘防治研究重點(diǎn)及努力方向[J].中華結(jié)核與呼吸雜志,2005,28(12):809-811.

[2]萬歡英.支氣管哮喘與慢性阻塞性肺疾病鑒析[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:22-28.

[3]Hayashi T,Adachi Y,Hasegawa K,et al.Less

[4]Gibson PG, Dolvoich J,Denburg J, et al.Chronic cough: eosinophilic bronchitis without asthma[J]. Lancet,1989,1(8651):1346-1348.

[5]Glaab T,Taube C,Braun A, et al.Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice[J].Respir Res,2007,8:63.

[6]Bates JH, Irvin CG. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle[J].J Appl Physiol,2003,94(4):1297-1306.

[7]Irvin CG,Bates JH.Measuring the lung function in the mouse:the challenge of size[J].Respir Res,2003,4:4.

[8]Kaczka D,Dellaca RL.Oscillation mechanics of the respiratory system: applications to lung disease[J].Crit Rev Biomed Eng,2011,39(4):337-359.

[9]Schuessler TF, Bates JH. A computercontrolled research ventilator for small animals:design and evaluation[J].IEEE Trans Biomed Eng,1995,42(9):860-866.

[10]Taube C, Dakhama A, Gelfand EW, et al.Insights into the pathogene-sis of asthma utiliz ing murine models[J].Int Arch Allergy Immunol,2004,135(2):173-186.

[11]Kips JC, Anderson GP, Fredberg JJ, et al. Murine models of asthma[J].Eur Respir J,2003,22(2):374-382.

[12]Kumar RK,Foster PS.Modeling allergic asthma in mice: Pitfalls and opportunities[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2002,27(3):267-272.

[13]Lloyd CM, Gonzalo JA, Coyle AJ, et al.Mouse models of allergic airway disease[J]. Adv Immunol,2001,77:263-295.

[14]商艷,李強(qiáng),黃怡,等.不同劑量致敏原對小鼠過敏性哮喘模型的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2002,23(1):69-71.

[15]沈璐,賴克方,姜華,等.不同激發(fā)方式對小鼠過敏性支氣管哮喘模型的影響[J].中華哮喘雜志,2009,36(15):404-408.

[16]陳曉紅,鐘南山,張衛(wèi)東,等.布地奈德對哮喘小鼠氣道重塑及JAK1/STAT6表達(dá)的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2007,87(23):1627-1632.

[17]DiGiovanni FA, Ellis R, Wattie J, et al.Concurrent dual allergen exposure and its effects on airway hyperresponsiveness,inflam mation and remodeling in mice[J]. Dis Model Mech,2009,2(5-6):275-282.

[18]Gore JC,Schal C. Cockroach allergen biology and mitigation in the indoor environment[J].Annu Rev Entomol,2007,52:439-463.

[19]Chang TT,Huang CC, Hsu CH.Inhibition of mite-induced immunoglobulin E synt hesis,Airway inflammation, and hyperreactivity by herbal medicine STA-1[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol,2006,28(4):683-695.

[20]Garantziotis S, Brass DM, Savov J, et al.Leukocytederived IL-10 reduces subepit helial fibrosis associated with chronically inhaled endotoxin[J]. Am J Respir Cell Mol Biol,2006,35(6):662-667.sensitivity for late airway inflammation in males than females in BALB/c mice[J].Scand J Immunol,2003,57(6):562-567.