吳海衛(wèi)，許 飚，景 華，王常田，錢建軍，董國(guó)華

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)過(guò)程中非生理性血流可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，造成各種器官功能損傷。小腸在SIRS發(fā)生發(fā)展中即是“靶”又是“源”，CPB后腸黏膜屏障功能的損害可以造成內(nèi)毒素入血、腸道菌群易位，從而觸發(fā)瀑布效應(yīng)，甚至引起多臟器功能障礙，影響臨床治療效果［1－2］。CPB引起腸道損傷的機(jī)制尚不清楚，本研究采用大鼠CPB模型，用熒光活體顯微鏡技術(shù)對(duì)小腸微循環(huán)變化進(jìn)行直接觀察，定量分析腸壁血流灌注、血管通透性及白細(xì)胞附壁情況，探討CPB后腸道損傷的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 采用450～550 g成年雄性SD大鼠，建立常溫CPB模型［3－4］。簡(jiǎn)要步驟如下，大鼠麻醉后氣管切開(kāi)接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，吸入氧濃度100%。左股靜脈置22G套管針，接微量輸液泵，維持靜脈通道;右側(cè)頸動(dòng)脈置24G套管針，連接動(dòng)脈泵管，用于CPB動(dòng)脈血泵入。右頸靜脈置入帶網(wǎng)狀側(cè)孔的16G穿刺導(dǎo)管，深入至右心房水平，引流靜脈血入貯血槽。全身肝素化(500 IU/kg)后開(kāi)始轉(zhuǎn)流。靜脈血由右房經(jīng)頸靜脈管依靠重力和虹吸引出，引流到位于心臟平面下方30 cm的開(kāi)放貯血槽，經(jīng)微型膜肺(廣東科威醫(yī)療器械有限公司，氣血交換面積0.05 m2，預(yù)充量4 ml)氧合，氧合血由小型蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司，BT00－300M型)泵入右頸動(dòng)脈。預(yù)充液由8 ml賀斯和8 ml供體血液構(gòu)成。在貯血槽和膜肺上方，用100W白熾燈照明加熱，以維持肛溫在36.5～38.3℃。逐漸增加流量，穩(wěn)定于100～150 ml/(kg·min)，維持平均動(dòng)脈壓在60～80 mm Hg。轉(zhuǎn)流60 min后，逐步降低灌注流量并停機(jī)，依次拔除各管道。緩慢輸入貯血槽中的余血，維持循環(huán)穩(wěn)定。繼續(xù)輔助呼吸120 min并進(jìn)行微循環(huán)觀察。20只大鼠隨機(jī)分為CPB組及對(duì)照組，每組各10只。兩組動(dòng)物手術(shù)操作相同，CPB組連接CPB裝置并轉(zhuǎn)流60 min，對(duì)照組同樣連接裝置并肝素化但不轉(zhuǎn)流。

1.2 活體觀察方法 在觀察開(kāi)始前，經(jīng)股靜脈分別注入異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛白蛋白(fluorescein isothiocyanate－bovine serum albumin，F(xiàn)ITC －BSA)(5%，0.2 ml/100 g)和吖啶橙(0.2%，0.1 ml/100 g)，其中FITC－BSA可以使血漿著色，以顯示腸壁毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，吖啶橙可以標(biāo)記體內(nèi)白細(xì)胞，使其細(xì)胞核在鏡下呈現(xiàn)為發(fā)光亮點(diǎn)。做腹部正中切口，將末段回腸連同腸系膜輕輕拉出腹外，逆腸系膜方向縱形切開(kāi)腸管約1 cm，以6－0單絲線縫于四周，舒展、固定于載玻片，置于觀察臺(tái)，連續(xù)用37～38℃生理鹽水表面灌流給腸壁保溫、保濕。黏膜及黏膜下層由通過(guò)切口由內(nèi)向外，漿膜層及肌層則直接從腸管外由外向內(nèi)進(jìn)行觀察。采用熒光顯微鏡(上海2XC4TV型)進(jìn)行活體觀察，用100W汞燈分別通過(guò)I2/3(綠色，波長(zhǎng)530～560 nm)和 N2(蘭色，波長(zhǎng)450～490 nm)濾色板頂部照明。分別于CPB前(T1)、CPB 30 min(T2)、CPB 60 min(T3)、CPB 后60 min(T4)、CPB后120 min(T5)對(duì)小腸微循環(huán)狀態(tài)進(jìn)行顯微觀察，選定有代表性的4個(gè)不交叉區(qū)域經(jīng)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，通過(guò)攝影、攝片記錄有關(guān)圖像資料，用Image J圖像分析系統(tǒng)做評(píng)估。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 選擇無(wú)分枝、長(zhǎng)度100μm、直徑30μm左右的小動(dòng)脈，測(cè)量其直徑變化;用逐禎回放分析技術(shù)，測(cè)量黏膜下層收集靜脈中的紅細(xì)胞流速;測(cè)量觀察區(qū)域內(nèi)熒光灌注毛細(xì)血管長(zhǎng)度，分別計(jì)算肌層、黏膜層單位面積FITC－BSA灌注毛細(xì)血管的長(zhǎng)度，即功能毛細(xì)血管密度(functional capillary density，F(xiàn)CD)，F(xiàn)CD 值以單位面積FITC－BSA灌注毛細(xì)血管的長(zhǎng)度表示(/cm)。

1.3.2 毛細(xì)血管通透性 FITC－BSA分子量大，正常情況下不能通透血管壁而位于血管腔內(nèi)，當(dāng)毛細(xì)血管通透性增加時(shí)，F(xiàn)ITC－BSA可穿過(guò)血管壁進(jìn)入組織間隙，使血管周圍出現(xiàn)散在的不規(guī)則斑片狀熒光。利用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)，將其轉(zhuǎn)為255灰階圖時(shí)，可以表現(xiàn)為灰度值增加，其增加幅度與FITC－BSA的漏出程度呈正相關(guān)。通過(guò)測(cè)定微血管周圍的灰度值變化，可以定量了解血管壁的通透性情況，灰度值越高，則表示組織間的大分子物質(zhì)越多，血管通透性就越大。

1.3.3 白細(xì)胞浸潤(rùn)情況 于高倍視野下找到黏膜下層清晰的毛細(xì)血管后微靜脈，通過(guò)攝像系統(tǒng)記錄白細(xì)胞的流動(dòng)狀態(tài)。將靜止于血管內(nèi)皮＞30 s和游走于血管外但仍在小血管旁的白細(xì)胞認(rèn)定為附壁狀態(tài)，對(duì)其計(jì)數(shù)，并計(jì)算100μm長(zhǎng)度血管的附壁白細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 小動(dòng)脈直徑 小動(dòng)脈直徑自CPB開(kāi)始后開(kāi)始逐步下降，到觀察結(jié)束時(shí)最為明顯，從(30.8±3.6)μM降至(20.6 ±3.7)μm，差異顯著(P ＜0.001)，這種血管收縮與小血管的自律運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)，見(jiàn)圖1。

2.2 小靜脈血流速度 CPB開(kāi)始后小靜脈內(nèi)血流速度減慢，隨著CPB時(shí)間的延長(zhǎng)，血流速度進(jìn)一步降低。在T4和T5時(shí)小靜脈血流速度仍持續(xù)降低，從T1時(shí)的(1.38±0.08)mm/s降為至 T5時(shí)的(0.44 ±0.06)mm/s，見(jiàn)圖2。

2.3 功能毛細(xì)血管密度 對(duì)照組黏膜層毛細(xì)血管網(wǎng)豐富，絨毛內(nèi)小血管細(xì)而迂曲，結(jié)構(gòu)清晰;肌層毛細(xì)血管網(wǎng)在正常情況下呈規(guī)則矩形，毛細(xì)血管網(wǎng)豐富，顯影清晰，見(jiàn)圖3A。CPB狀態(tài)下可見(jiàn)到明顯的血管充盈減少，并有血管邊緣模糊表現(xiàn);轉(zhuǎn)流后120 min FITC－BSA灌注血管影明顯減少，并有相互之間的交通中斷現(xiàn)象，見(jiàn)圖3B。對(duì)照組肌層和黏膜層FCD值隨時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化，而CPB后則逐漸減少，至CPB后120 min時(shí)分別由從CPB前(511±17)/cm和(221±13)/cm降為(150±17)/cm和(64 ±7)/cm，差異顯著(P ＜0.001)，見(jiàn)圖4。

2.4 毛細(xì)血管通透性 對(duì)照組術(shù)后120min毛細(xì)血管輪廓清晰，F(xiàn)ITC－BSA局限于血管內(nèi)，血管周圍背影黑暗，見(jiàn)圖5A。CPB轉(zhuǎn)流開(kāi)始后，隨時(shí)間延長(zhǎng)可以見(jiàn)到逐步增多的血管外透亮區(qū)，在小腸黏膜層絨毛微血管和黏膜下層毛細(xì)血管后微靜脈中尤為明顯，至觀察結(jié)束時(shí)，個(gè)別小血管結(jié)構(gòu)變得模糊不清，邊界難以確認(rèn)，見(jiàn)圖5B。定量分析則表現(xiàn)為小血管周圍灰度值的逐步增加，由開(kāi)始時(shí)的(142±7)升至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的(220±13)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.001)，表明CPB后小血管通透性增加。見(jiàn)圖6。

2.5 白細(xì)胞浸潤(rùn)情況 對(duì)照組毛細(xì)血管內(nèi)很少見(jiàn)到附壁白細(xì)胞，毛細(xì)血管內(nèi)偶見(jiàn)被吖啶橙染亮的白細(xì)胞顆粒，見(jiàn)圖7A，箭頭所示為停留于血管邊緣的白細(xì)胞，在吖啶橙染色下呈現(xiàn)桔紅色顆粒;而CPB組大鼠在轉(zhuǎn)流120 min后，附壁的白細(xì)胞數(shù)目明顯增加，以黏膜下層小靜脈內(nèi)最為突出，可見(jiàn)到許多的白細(xì)胞亮點(diǎn)聚集于小血管內(nèi)及血管周邊，見(jiàn)圖7B。定量分析顯示白細(xì)胞附壁數(shù)由CPB前(2.8±1.3)個(gè)/100 μM升至(30.3±1.3)個(gè)/100 μm，差異顯著(P ＜0.001)，見(jiàn)圖8。

3 討論

限于倫理道德方面的制約，對(duì)CPB所致胃腸道損傷及其在術(shù)后全身炎癥反應(yīng)中作用的研究，在人體上難以深入，大多限于臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)或間接測(cè)定，如:對(duì)術(shù)后消化系統(tǒng)并發(fā)癥的分析、Doppler超聲腹內(nèi)血管血流測(cè)定、動(dòng)脈－胃黏膜pHi測(cè)定等，從而推斷胃腸道缺血及黏膜損傷程度，無(wú)法做到直接、定量分析，進(jìn)一步的研究必須依賴適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型［4－5］。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠CPB模型，采用活體熒光顯微鏡技術(shù)，對(duì)小腸微血管形態(tài)、管壁結(jié)構(gòu)完整性及血管內(nèi)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行直接、定量觀察和分析研究。過(guò)去的研究常采用腸系膜作為微循環(huán)觀測(cè)對(duì)象，然而，腸系膜與腸壁內(nèi)的微血管在結(jié)構(gòu)分布和血流狀態(tài)上存在很大差別，且腸壁各層之間也有明顯不同［6－7］，因此，必須對(duì)腸壁各層(包括絨毛層、黏膜層、黏膜下層及肌層等)微循環(huán)直接觀測(cè)，才是判斷其損傷程度最直觀、有效的方法。

通過(guò)上述方法，我們發(fā)現(xiàn)，CPB可造成腸道缺血、血管通透性增加和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理現(xiàn)象。CPB后小動(dòng)脈管徑變細(xì)，伴隨著血流速度減慢，導(dǎo)致腸壁血供減少、灌注不足;FCD進(jìn)行性下降，到觀察結(jié)束時(shí)，大約只有轉(zhuǎn)流前的30%，表明腸道存在血流重新分布，腸壁缺血的程度嚴(yán)重;白蛋白的外溢，顯示血管壁通透性增加，屏障功能受損，而周圍組織的水腫形成，可以進(jìn)一步加重微循環(huán)損害;小靜脈內(nèi)聚集的附壁白細(xì)胞，可能是最早參與炎癥反應(yīng)的活化細(xì)胞，它們產(chǎn)生、釋放各種炎性介質(zhì)，破壞血管內(nèi)皮完整性，加重液體外滲，并在隨后的病理改變中伴演重要角色。研究還發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)血管和黏膜下收集靜脈的改變最早、最明顯，是CPB損傷中最易受影響的結(jié)構(gòu)單元。而轉(zhuǎn)運(yùn)毛細(xì)血管減少和腔內(nèi)淤滯，可以導(dǎo)致小腸肌層毛細(xì)血管灌注和營(yíng)養(yǎng)紊亂，肌肉活力喪失或減少，最后導(dǎo)致腸麻痹［8］。

實(shí)驗(yàn)中為了避免藥物作用的影響，未使用任何血管活性藥物，然而在這種狀態(tài)下，小腸微循環(huán)損傷的改變?nèi)匀环浅Ｃ黠@。因此，可以認(rèn)為，CPB導(dǎo)致的小腸微循環(huán)缺血不僅僅是機(jī)體低灌注或低心排的結(jié)果，而非生理性轉(zhuǎn)流過(guò)程中的血流重新分配可能是最初的致傷原因［9］。值得注意的是，這種損傷在CPB結(jié)束后的2小時(shí)沒(méi)有任何緩解的征象，反而達(dá)到了高峰。這表明，CPB誘發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是腸道損傷最主要的機(jī)制，CPB過(guò)程盡管已經(jīng)停止，但炎癥反應(yīng)卻仍在繼續(xù)。CPB過(guò)程中血液和血細(xì)胞與體外管道人工表面接觸、泵的機(jī)械損傷、缺血再灌注損傷導(dǎo)致白細(xì)胞活化、炎性介質(zhì)釋放、血漿酶、補(bǔ)體活化、白細(xì)胞溢出、氧自由基釋放［10－11］，這些都可以直接或間接影響微循環(huán)，導(dǎo)致血管收縮，血液濃縮和血流淤滯，隨后內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，阻塞血管，血管通透性增加，大分子滲漏。

總之，本研究利用大鼠CPB模型和活體熒光顯微鏡技術(shù)，直觀地研究了CPB所致小腸微循環(huán)進(jìn)行性損傷的現(xiàn)象，初步揭示了其微觀病理生理機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在體循環(huán)狀態(tài)穩(wěn)定的情況下，常溫CPB可以導(dǎo)致大鼠明顯而持續(xù)的小腸微循環(huán)損傷，血流重新分配和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)可能是最主要的致傷因素。

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