張莉，于浩泉，高德鵬，王曉東，和天天，蘇曼琳，韓淵懷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，山西 太谷030801；2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京100083）

珍珠粟（Pennisetum glaucum）屬于禾本科黍族狼尾草，為糧食飼料兼用的一年生草本植物，又稱蠟燭稗或御谷。珍珠粟在谷類中被認為是世界上第六大重要熱帶食物，其主要生長在非洲西部和印度等半干旱地區(qū)。在貧瘠的沙土和干旱地區(qū)，珍珠粟是唯一可靠的糧食和飼料作物；在非洲和亞洲的干旱地區(qū)，珍珠粟是主要的糧食作物；在南美等熱帶和亞熱帶地區(qū)，珍珠粟被廣泛的用于夏季牧場作物［1］。

作物的產(chǎn)量在很大程度上會受一些環(huán)境條件的影響，如干旱、高溫、低溫、高鹽等。作物在這些非生物因子的脅迫下，會產(chǎn)生各種不同的生理和分子響應(yīng)，包括基因表達、新陳代謝、滲透壓調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)修復(fù)系統(tǒng)改變，以及對于病菌侵染時的響應(yīng)等，這些過程影響著作物的分布、生長和產(chǎn)量。早在1985年，Guy等就通過研究在低溫條件下基因的表達變化，以了解植物中的非生物脅迫應(yīng)答通路［2］。通過不同的文庫篩選，研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了RD29A等脫水應(yīng)答基因。不久，研究者又通過單酵母雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，脫水應(yīng)答元件結(jié)合因子（DDREB）結(jié)合于RD29A啟動子的脫水應(yīng)答元件（DRE）上［3，4］。使用相似的方法，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一系列低溫應(yīng)答基因［5］。前期關(guān)于脅迫相關(guān)通路的研究主要以前基因組時代的表達譜方法為主，如：先進行不同文庫的篩選，再進行分子和生物學(xué)功能分析的方法。以全基因組表達譜為代表的表達譜芯片技術(shù)為全基因組表達研究提供了可能。Kreps等通過包含約8000個基因的表達譜芯片，研究了擬南芥在受到傷害脅迫時的表達譜變化。研究表明，其中17個受傷害等生物脅迫誘導(dǎo)的基因，在低溫、干旱、高鹽和ABA處理的非生物脅迫條件下也會受到誘導(dǎo)，這些基因包括經(jīng)常出現(xiàn)在非生物脅迫應(yīng)答中的CBF1和CBF2基因和一些水通道蛋白，而大多傷害應(yīng)答基因與病菌應(yīng)答通路中的基因一致［6～8］。

除了非生物脅迫外，病菌、害蟲、寄生植物等生物脅迫對植物的產(chǎn)量也有著很大的影響。已有研究表明，植物的病菌抗性可以被茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、乙烯（ET）和硫代葡萄糖苷及他們的水解產(chǎn)物等調(diào)節(jié)。生物脅迫往往會引起JA、SA、ET等相關(guān)信號通路的變化，JA、SA、ET等會作為信號分子來激發(fā)一些植物的抗性反應(yīng)，來響應(yīng)或抵抗外來的生物脅迫。通過研究擬南芥的c DNA表達譜分析研究表明，在擬南芥受到黑斑菌侵染或用防衛(wèi)相關(guān)信號分子，如：SA、茉莉酸甲酯（MeJA）、ET等一種或多種處理下，705個mRNA分子的表達都發(fā)生了變化，其中包括已知的及預(yù)測的防衛(wèi)相關(guān)基因和106個還沒有任何功能或同源注釋的基因。調(diào)節(jié)防衛(wèi)反應(yīng)的169個基因可以被多種處理或防衛(wèi)通路調(diào)控。在SA和MeJA處理后，一些基因表現(xiàn)為共誘導(dǎo)或共抑制，可見在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中，不同的防衛(wèi)信號通路水楊酸和茉莉酸通路存在相互或協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)網(wǎng)路［9］。Rayapuram等通過分析煙草在受到動物傷害時JA和SA的水平來研究生物脅迫對防御系統(tǒng)的影響。研究表明，當(dāng)用SA處理煙草時，Na NPR1基因的轉(zhuǎn)錄水平會升高，而當(dāng)將Na NPR1基因沉默，植物就更易受到動物和病菌傷害的影響。通過生物芯片分析表明，在NPR1基因沉默的植物中，一些JA誘導(dǎo)基因下調(diào)，而一些SA合成基因上調(diào)。所以，可以推斷，當(dāng)植物受到動物傷害時，NPR1基因調(diào)控SA的產(chǎn)生量，進而引起JA介導(dǎo)的防御反應(yīng)，在NPR1基因沉默的植物中，SA產(chǎn)量增加，JA相關(guān)防御減弱使得植物更易受到動物的影響［10］。

在所有谷類作物中，珍珠粟是最耐熱和干旱的植物。即使在高溫和干旱環(huán)境下，珍珠粟相對于玉米，甚至高粱，仍會有較高產(chǎn)量［11］。雖然珍珠粟相比玉米與高粱具有更好的抗病害能力，但其產(chǎn)量也會受到病害的影響，其中一種病害就是由寡紋柄銹菌（Puccinia substriata，P.substriata）導(dǎo)致的銹病。本文通過分析珍珠粟在受到SA處理后，與寡紋柄銹菌下共表達的基因，來分析SA處理對生物脅迫的影響，為防治病菌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所分析的基因芯片數(shù)據(jù)來源于NCBI中的 GEO數(shù)據(jù)庫（http：／／www.ncbi.nl m.nih.gov／geo／），序列號為 GSE13481。該c DNA 文庫由Van den Ber g等人創(chuàng)建［12］，是珍珠粟中對各種防御響應(yīng)的基因芯片序列。在1920個c DNA中，有355個c DNA在脅迫響應(yīng)中進行差異表達。Van den Berg等將其中135個在SA和MeJA處理下差異表達最顯著的c DNA挑選出來進行測序，得到的序列信息在NCBI上比對，得到66個非重復(fù)序列。這些c DNA序列儲存在GENBANK db EST數(shù)據(jù)庫中，序號為GD180624～GD180688。

1.2 試驗方法

1.2.1 聚類分析與共表達分析

將Van den Ber g等比對到的各物種GI號，間接比對到擬南芥的基因上，對其中的所有基因進行聚類分析，采用Spear man秩相關(guān)分析，質(zhì)心連鎖的聚類方法得到表達數(shù)據(jù)的聚類。同樣利用Spear man秩相關(guān)，檢驗各個基因間的相關(guān)系數(shù)（p＜0.05）構(gòu)成相關(guān)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.2 差異基因分析與功能注釋

利用超幾何分布對上調(diào)和下調(diào)的差異基因進行功能注釋分析，F(xiàn)isher精確概率檢驗計算P值，Benjamini－Yekutieli方法對多重檢驗結(jié)果進行校正，篩選其中表達差異2倍及以上，并且FDR＜0.05富集的Go Terms。

2 結(jié)果

2.1 聚類及共表達分析

水楊酸和寡紋柄銹菌處理后，對珍珠粟中差異表達2倍或以上的c DNA進行層次聚類分析（圖1），結(jié)果表明，相較于不同處理下的樣本表達概型，每種處理內(nèi)部的時序樣本表達概型之間更加相近。

圖1 水楊酸和寡紋柄銹菌處理后，珍珠粟中c DNA差異表達2倍或以上的層次聚類分析Fig.1 Hierarchical cluster of sequenced pearl millet c DNAswitht wofold or more changes in transcript abundance in response to SA or Puccinia substriata treat ment

同樣利用Spear man秩相關(guān)檢驗各個基因間的相關(guān)系數(shù)（p＜0.05）構(gòu)成相關(guān)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。由 圖 可 見 GAPC1，LOS2，ALF5，HSP70，RD22等基因有顯著的共表達關(guān)系，他們共同參與了化學(xué)刺激響應(yīng)和脅迫響應(yīng)等多種生物過程。AT 1G54290、AT 5G60390、ALAAT 2、AT 3G14770、LOS2、GAPC1等基因均與其他多個基因有共表達關(guān)系，預(yù)示著這些基因在植株各種生物過程中可能發(fā)揮重要作用。

2.2 差異表達基因分析

由表1可以看出，經(jīng)SA處理過的植株，其體內(nèi)多個與脅迫相關(guān)的基因表達量顯著上調(diào)，這些基因有 HSP70、ALF5、AT1G66100、PPC2、PGK、LOS2、 GAPC1、 AT4G24690、 AT1G54290、AT3G14770、RD22和NPQ4。

表1 差異基因列表（相對于t＝0 h的差異倍數(shù)（比值））Table 1 Differential expression genes in pearl millet（relative to t＝0 h）

圖2 共表達網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.2 Co－expression net wor k analysis

2.3 差異基因的功能注釋

利用超幾何分布對上調(diào)和下調(diào)的差異基因進行功能注釋分析，F(xiàn)isher精確概率檢驗計算P值，并用Benjamini－Yekutieli方法［13］對多重檢驗結(jié)果進行校正，篩選其中表達差異2倍及以上，并且FDR＜0.05富集的GoTerms（表2、表3）。

表2 上調(diào)基因集在GO在生物學(xué)過程中的注釋分析（前10個）Table 2 GO Ter ms enrich ment analysis in biological process with the up－regulated genes（top 10）

表3 下調(diào)基因集在GO在生物學(xué)過程中的注釋分析（前10個）Table 3 GO Ter ms enrich ment analysis in biological process with the down－regulated genes（top 10）

3 結(jié)論與討論

病原體在宿主植株上的是否能成功發(fā)揮毒性體現(xiàn)在病原體逃避或者操作宿主反應(yīng)的能力上［11～14］。SA預(yù)處理提高了植株對銹病侵染的耐受性，說明SA誘導(dǎo)出的防御反應(yīng)相關(guān)基因表達在植株對銹病侵染的抵抗過程中發(fā)揮著重要的作用。我們推測P.substriata病毒在侵染的過程中可以成功抑制宿主體內(nèi)SA誘導(dǎo)的防御反應(yīng)。我們觀察到可能的SA介導(dǎo)的防御關(guān)鍵基因包括HSP70、AT3G25570、ALF、AT1G66100、PPC2、PGK、ALAAT2、LOS2、GAPC1、AT4G24690、AT5G60390、AT1G54290、AT3G14770、RD22 和NPQ4。這些基因在病毒侵染過程中被抑制或者沒有被誘導(dǎo)。它們很可能成為病原體在植株中產(chǎn)生毒性效應(yīng)的可操作的靶標(biāo)，這與以往研究描述一致［15］。

SA預(yù)處理過的植株誘導(dǎo)出若干差異表達基因在多種應(yīng)急響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，包括鹽脅迫響應(yīng)、溫度刺激響應(yīng)、滲透脅迫響應(yīng)、化學(xué)刺激響應(yīng)、干旱響應(yīng)、毒素響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、病毒響應(yīng)、有機質(zhì)響應(yīng)等，說明眾多應(yīng)激響應(yīng)有部分類似的機制。其中共同高頻出現(xiàn)的基因包括：LOS2、GAPC1、NPQ4、ALF5、AT1G66100、HSP70 和RD22。這些關(guān)鍵基因多分布于細胞膜、細胞外周和胞間部分。病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)證明，HSP70基因是植物防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成分［16］。LOS2是一個響應(yīng)冷脅迫的基因，在植物抗凍響應(yīng)中具有重要的作用［17］。RD22是一個脫水應(yīng)答基因，其表達受脫水、高鹽、ABA誘導(dǎo)，但不受冷、熱脅迫誘導(dǎo)［18］。

在差異表達的基因中，ADR1－L 1、AVP1、AT4G02610、AT1G62290、RPT2A、T15 M6、HRE1、BGLU11、AT3G27210、PR1、UGT 74F1 和SCPL 6都不同程度的在P.substriata病毒接種植株中的表達量高于SA預(yù)處理的植株。尤其是若干基因看似由SA介導(dǎo)，但卻在P.substriata病毒接種植株中表現(xiàn)出極高的表達量，例如：編碼病程相關(guān)蛋白的基因PR1（表達量上調(diào)接近50倍），編碼UDP糖基轉(zhuǎn)移酶74F1的UGT 74F1基因（表達量上調(diào)70多倍）及編碼絲氨酸羧基肽酶類6的SCPL6基因（表達量上調(diào)近92倍）。

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