楊慧妮，武曉英，2，張春香，任有蛇，岳文斌

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷030801；2.太原師范學(xué)院 生物系，山西 太原030006）

轉(zhuǎn)錄因子GATA－4是具有鋅指結(jié)構(gòu)的GATA家族中的第四個(gè)成員。該家族轉(zhuǎn)錄因子具有與特定DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化過程中高度保守［1］。1996年 Huang等［2］應(yīng)用原位雜交技術(shù)將人的GATA－4定位于8p23.1→p22，c DNA 全長3372 bp，有6個(gè)外顯子，編碼442個(gè)氨基酸。GATA－4在中胚層和內(nèi)胚層起源的組織中廣泛表達(dá)（如心臟、睪丸和卵巢等）。最初發(fā)現(xiàn)GATA－4可以調(diào)控心臟發(fā)育，隨后證明它是成年心臟肥大的一個(gè)重要調(diào)控因子。GATA－4調(diào)控多種基因的表達(dá)，其調(diào)控作用在心臟、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和癌癥中均占有重要地位。因此GATA－4的正反調(diào)控是其生物功能的重要組分［3］。

在過去十年中，大量研究了轉(zhuǎn)錄因子GATA在人類疾病中的作用［4］。目前GATA－4已成為研究的焦點(diǎn)，表明其在雄性性別決定、類固醇激素合成和細(xì)胞存活上有重要作用。尤其是在哺乳動物的繁殖有多個(gè)途徑的調(diào)控上，可能有著決定性作用［5］。國外研究表明，GATA－4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)于Sertoli細(xì)胞，類固醇合成的睪丸Leydig細(xì)胞和其他睪丸體細(xì)胞［6］，這說明GATA－4轉(zhuǎn)錄因子在睪丸中有表達(dá)，但在睪丸各類細(xì)胞中的表達(dá)情況如何，則報(bào)道很少［7］。本研究從分子水平探討不同能量水平下睪丸中GATA－4 mRNA表達(dá)規(guī)律，并用免疫組化技術(shù)對睪丸中GATA－4進(jìn)行定位研究，希望能夠?yàn)樘接慓ATA－4在睪丸分化以及通過調(diào)控激素進(jìn)而調(diào)控動物繁殖性能方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

DEPC：Sig ma公司

RNAiso Plus（Code：D9108A）：Ta Ka Ra生物工程公司

Pri meScript?RT Master（Code：DRR036A）：Ta Ka Ra生物工程公司

SYBR?Premix Ex TaqTMII （Code：DRR820 A）：Ta Ka Ra生物工程公司

兔抗性GATA－4一抗：北京博奧森生物技術(shù)有限公司生物素標(biāo)記的鼠抗兔二抗：武漢博士德生物公司即用型SABC免疫組化試劑盒：武漢博士德生物公司

DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物公司

1.1.2 試驗(yàn)動物

選用18只健康的、體重相近的杜泊羊×小尾寒羊未去勢雜種公羔。在10天的適應(yīng)期后，將18只羔羊隨機(jī)分配到飼喂能量蛋白水平不同的3組中：自 由采食組 （Voluntary feed intake，VFI）、35%VFI組和65%VFI組。其中35%VFI組能量攝入為自由采食組的35%，65%VFI組能量攝入為自由采食組的65%。當(dāng)自由采食組體重達(dá)35 kg時(shí)各組分別屠宰取樣。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取材及組織處理

通過頸靜脈放血致死，取睪丸組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗表面的脂肪及血漬，DEPC水處理過的刀片分割成小塊，經(jīng)RNA酶滅活處理的錫箔紙包好快速裝入預(yù)冷的凍存管中。每只另取相同部位睪丸組織，切成0.3 c m×0.5 c m×0.5 c m左右，用4%多聚甲醛在4℃固定24 h，0.01 mol·L－1PBS（p H 7.4）洗3次，進(jìn)行脫水、包埋、5μm厚石蠟切片。

1.2.2 綿羊睪丸組織總RNA的提取

參照Ta Ka Ra公司RNAiso Plus實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行睪丸組織總RNA的提取。

1.2.3 總RNA濃度的測定

通過Nanodr op－1000核酸蛋白測定儀檢測純度、濃度及 A260／A280。

1.2.4 c DNA第一鏈的合成

使用Pri meScriptTMRT Master中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，反應(yīng)體系（10μL）如下：5×Pri meScriptTMBuff er 2μL，Total RNA 1μL，RNase－Free d H2O 7μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7℃15 min，85℃ 5 s。所得c DNA 用 Nanodr op－1000核酸蛋白測定儀檢測后可于－20℃保存3個(gè)月。

1.2.5 Real－time PCR檢測不同能量水平下睪丸組織中GATA－4的表達(dá)

1.2.5.1 引物的設(shè)計(jì)及合成

本研究Real－time PCR以18S r RNA為內(nèi)參基因，參考Gen Bank上已登錄的牛的GATA－4（NM＿001192877）的 mRNA 序列，利用 Pri mer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成兩對特異性引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Pri mer sequences of quantitative PCR

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及定量分析

將c DNA 5×稀釋8個(gè)梯度后進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，軟件自動得出目的基因GATA－4與內(nèi)參基因18S r RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、擴(kuò)增效率R2及線性方程系數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動計(jì)算出每個(gè)樣本中每微升18S r RNA和GATA－4的拷貝數(shù)。以內(nèi)參基因18S r RNA的表達(dá)量將所測定的所有組織樣品的GATA－4 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得出對應(yīng)的各個(gè)能量水平下的相對表達(dá)量。

1.2.5.3 Real－time PCR反應(yīng)

根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒（表1）建議的反應(yīng)體系及優(yōu)化確定的反應(yīng)條件，進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的相對定量分析。不同組織重復(fù)試驗(yàn)6只公羊，每種組織另設(shè)技術(shù)重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熔解曲線CT值計(jì)算定量結(jié)果。反應(yīng)體系（10μL）如下：SYBR Premix Ex Taq II（2×）5μL、上下游引物各0.25μL，c DNA溶液1 μL，dd H2O 3.3μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL。擴(kuò)增條件為：95℃30 s，（95℃30 s，63℃35 s）60 Cycles，95℃15 s、63℃1 min、95℃15 s。

1.2.6 睪丸組織免疫組化染色

切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟；3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫10 min；水洗3 min×2次；加復(fù)合消化液抗原修復(fù)37℃，30 min；PBS洗3 min×3次；5%BSA封閉液室溫封閉30 min；去除多余液體，滴加1∶300稀釋Rabbit Anti－GATA－4多克隆一抗，濕盒內(nèi)4℃過夜；PBS洗5 min×3次；加生物素標(biāo)記二抗37℃，30 min；PBS洗5 min×3次；DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗2～3次終止顯色；蘇木精復(fù)染1 min，0.5%HCl酒精洗1 min；自來水沖洗2 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。同時(shí)設(shè)置陰性對照，用PBS代替一抗，其余步驟同上，確定免疫反應(yīng)的特異性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量控制及RT－PCR檢測

所提取睪丸總RNA純度 A260／A280均介于1.8～2.0，表明所提取的RNA質(zhì)量可靠，符合反轉(zhuǎn)錄要求。并且以RT－PCR反應(yīng)的產(chǎn)物c DNA為模板進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的PCR反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳均可檢測到擴(kuò)增結(jié)果，表明反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可用于后續(xù)目的基因的定量PCR。

2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1A、B分別為相對濃度57、56、55、54、53和52拷貝的18S r RNA和GATA－4 Real－time PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線。目的基因和內(nèi)參基因基線平穩(wěn)，拐點(diǎn)清楚，平行性較好；圖1 C顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線只有單一的峰，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體；圖1 D為軟件自動繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在6個(gè)濃度梯度上呈良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率在100%～110%，回歸系數(shù)分別為0.997和0.998，說明本研究建立的GATA－4和18S r RNA定量檢測方法有效。

圖1 GATA－4與18S r RNA基因擴(kuò)增動力學(xué)曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品熔解曲線Fig.1 PCR amplification plots，standard curves and dissociation curves for GATA－4 and 18Sr RNA

2.3 不同能量水平下GATA－4 mRNA的表達(dá)差異

由圖2可以看出，經(jīng)過內(nèi)參18Sr RNA對綿羊睪丸GATA－4表達(dá)量的校正，GATA－4在自由采食組的表達(dá)量最多，其他能量水平與其相比差異極顯著（P＜0.01），順序依次為：35%VFI組＜65%VFI組＜自由采食組（VFI）。

2.4 GATA－4在不同能量水平下睪丸中的表達(dá)特點(diǎn)

鑒于GATA－4 mRNA在不同能量水平下睪丸中表達(dá)水平不同，采用免疫組化技術(shù)對GATA－4進(jìn)行定位研究。結(jié)果顯示，GATA－4免疫反應(yīng)產(chǎn)物在35%VFI、65%VFI、自由采食3個(gè)能量水平綿羊睪丸組織中均有分布，且在各級生精細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞均有表達(dá)，而陰性對照DAB染色結(jié)果則無明顯表達(dá)產(chǎn)物（圖3）。

圖2 不同能量水平下綿羊睪丸中GATA－4 mRNA相對表達(dá)量Fig.2 Relative GATA－4 mRNA expression in the testes of sheep at different energy levels

圖3 綿羊睪丸組織GATA－4表達(dá)結(jié)果（免疫組化×400）Fig.3 Expressions of GATA－4 in the testis of different groups of sheep（immunoh is tochemistry×400）

從圖3可看出，在35%VFI能量水平下，GATA－4主要表達(dá)于Sertoli細(xì)胞中，在Leydig細(xì)胞和生精細(xì)胞中有少量表達(dá)，且精子的形成量明顯少于65%VFI和自由采食能量水平。GATA－4在自由采食組個(gè)體的Leydig細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞中表達(dá)較多，但更多地表達(dá)于生精細(xì)胞。自由采食組中，GATA－4表達(dá)陽性的生精細(xì)胞率以及精子量也明顯高于65%VFI能量水平（表2）。

表2 不同能量水平下小鼠睪丸組織中GATA－4的陽性細(xì)胞率Table 2 Percentage of positive cells for GATA－4 expression in the testes of sheep at different energy levels

3 結(jié)論與討論

GATA家族在哺乳動物卵巢和睪丸的多種細(xì)胞中均有表達(dá)，對生殖系統(tǒng)的發(fā)育具有重要意義，可調(diào)控動物的性別決定和生殖功能。GATA－4在豬的性別分化到性成熟的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，從睪丸分化到成熟階段，也檢測到Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞存在GATA－4 mRNA。研究結(jié)果表明，GATA－4轉(zhuǎn)錄因子能通過與SF－I轉(zhuǎn)錄因子的相互作用轉(zhuǎn)錄激活繆勒氏抑制素，從而導(dǎo)致繆勒氏導(dǎo)管的單向退化和中腎導(dǎo)管系統(tǒng)的發(fā)育增強(qiáng)，進(jìn)而影響性別分化［8，9］。進(jìn)一步的研究證明，轉(zhuǎn)錄因子GATA－4和GATA－6在哺乳動物性腺細(xì)胞系的分化和生殖過程中各激素的調(diào)節(jié)上都有著不可或缺的作用［10］。

動物的營養(yǎng)狀況與其生產(chǎn)、繁殖密切相關(guān)。能量是哺乳動物營養(yǎng)的基礎(chǔ)，也是生殖細(xì)胞生長發(fā)育和合成生殖激素的物質(zhì)基礎(chǔ)［11］。不同能量水平下GATA－4 mRNA在綿羊睪丸組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，這與能量攝入量是密切相關(guān)的，說明能量水平影響GATA－4 mRNA的表達(dá)量。能量水平同樣會影響哺乳動物促性腺激素釋放激素（Gn RH）的脈沖產(chǎn)生系統(tǒng)及性腺素的釋放。景彩霞等認(rèn)為，促性腺激素可以上調(diào)GATA－4的表達(dá)［12］，在睪丸Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的增殖旺盛時(shí)期表達(dá)增強(qiáng)。GATA－4因子可正向調(diào)控性腺軸激素的表達(dá)量，其大量結(jié)合會提高Gn RH的分泌量，進(jìn)而直接影響FSH和L H等激素的分泌，且GATA－4參與FSH到Gn RH的反饋調(diào)節(jié)路徑。這說明GATA－4的表達(dá)與性腺軸激素的分泌和表達(dá)存在著相互調(diào)控的關(guān)系，但是其調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

精子的成熟離不開GATA－4對Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的調(diào)控［13］。GATA－4通過調(diào)控Sertoli細(xì)胞及Leydig細(xì)胞來促進(jìn)精子成熟，還可直接作用于生精細(xì)胞來促進(jìn)精子的形成。通過免疫組化技術(shù)定位GATA－4在睪丸組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GATA－4在35%VFI組睪丸組織生精細(xì)胞的表達(dá)量明顯少于65%VFI組和自由采食組，且精子的形成量也明顯少于65%VFI組和自由采食組，順序由小到大依次為：35%VFI組＜65%VFI組＜自由采食組，可見GATA－4的表達(dá)量與生精細(xì)胞的增殖和精子的形成有著密切聯(lián)系。直觀驗(yàn)證了GATA－4 mRNA在睪丸中表達(dá)存在差異的結(jié)果，故推測睪丸組織中GATA－4 mRNA表達(dá)差異是由能量攝入量不同造成的，其調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。

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