高中元，林婄婄，袁亞男，周沙沙，劉寶鳳，劉建華，梁 琛，喬利英，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

脂滴包被蛋白（perilipin）是一種可磷酸化的脂滴相關(guān)磷蛋白［1］，由PLIN基因編碼，在蛋白激酶A調(diào)控的脂肪代謝中具有重要作用［2，3］。在人和小鼠上的研究表明，PLIN基因主要在脂肪組織中表達(dá)［4，5］，對(duì)脂肪組織中甘油三酯的儲(chǔ)存和分解具有重要的雙重調(diào)控作用［6，7］，在類固醇生成細(xì)胞中有少量表達(dá)，主要調(diào)控膽固醇酯、類固醇激素合成前體的分解［8］。PLIN基因敲除的小鼠瘦體重（lean body mass）較大，脂肪細(xì)胞較小，表明它能增加瘦素（leptin）的表達(dá)，并且能夠抵抗飲食誘導(dǎo)的肥胖［9］。對(duì)人類的研究發(fā)現(xiàn)，PLIN基因在肥胖個(gè)體的脂肪組織中過量表達(dá)［10］，且該基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與體脂重、低體重指數(shù)、肥胖風(fēng)險(xiǎn)以及總膽固醇水平關(guān)聯(lián)［11～13］。對(duì)豬PLIN基因的研究表明，PLIN基因多態(tài)性與豬的平均日增重、瘦肉率和背膘厚關(guān)聯(lián)［14］。對(duì)秦川牛的研究表明，PLIN基因多態(tài)性對(duì)脂肪沉積有一定影響，可作為改善牛肉品質(zhì)和肉牛品種改良的候選基因［15］。

然而，PLIN基因在綿羊上的研究還未見報(bào)道。尾部是綿羊脂肪沉積和能量存儲(chǔ)的重要部位，尾形的差異可能反映脂肪代謝水平的不同。鑒于該基因?qū)C(jī)體脂肪代謝的重要作用，本研究以PLIN基因?yàn)槟康幕颍捎肞CR－SSCP方法，檢測(cè)兩個(gè)具有明顯尾形差異的綿羊品種的PLIN基因多態(tài)性，并分析這些多態(tài)與尾形和屠宰性狀可能存在的關(guān)聯(lián)，為肉用綿羊品種改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

廣靈大尾羊（Guangling Large Tailed sheep，GLT）和小尾寒羊（Small Tailed Han sheep，STH）都起源于蒙古羊，同屬于脂尾型綿羊，但尾型差異顯著。廣靈大尾羊?qū)匍L(zhǎng)脂尾型綿羊，尾大蓄脂力強(qiáng)，肉用性能好，但繁殖力低；小尾寒羊?qū)俣讨残途d羊，尾小蓄脂力弱，肉用性能一般，但繁殖力高［16，17］。

血樣采自2、4、6、8、10和12月齡健康狀況良好的廣靈大尾羊和小尾寒羊。每品種每階段8只，公母各半，共計(jì)96只。宰前稱空腹重，測(cè)量尾長(zhǎng)和尾寬，每個(gè)個(gè)體頸靜脈采血10 mL，加入2 mL ACD抗凝劑，－70℃保存?zhèn)溆?。宰后稱胴體重和尾脂重，計(jì)算屠宰率和相對(duì)尾脂重（尾脂重／胴體重）。

1.2 基因組DNA的提取

采用常規(guī)的酚－氯仿抽提法提取綿羊血樣基因組DNA，提取的DNA用TE緩沖液溶解稀釋，然后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PLIN基因引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)，根據(jù)Gen Bank提供的綿羊PLIN基因 mRNA序列（NM＿001113773.1）及牛PLIN基因序列（NC＿007319），利用 Pri mer 3 Plus（http：／／www.bioinfor matics.nl／cgi－bin／pri mer3plus／pri mer3plus.cgi）在線設(shè)計(jì)引物，每個(gè)外顯子設(shè)計(jì)1對(duì)引物，共設(shè)計(jì)9對(duì)引物，包含整個(gè)編碼區(qū)序列（表1）。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度Table 1 Primer sequence，product sizes and annealing temperature

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15μL：模板DNA 1 μL，上下游引物各0.6μL，10×Buffer緩沖液1.5 μL，d NTP 1.2μL，Taq DNA 聚合酶0.3μL，滅菌dd H2O 9.8μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃4 min；94℃30 s、退火30 s、72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 PCR產(chǎn)物的SSCP分析

將1μL PCR產(chǎn)物和9μL緩沖液混合，98℃變性10 min，冰浴20 min，使產(chǎn)物保持變性狀態(tài)，在1×TBE電泳緩沖液中用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，先300 V高電壓電泳15 min，再130 V電壓電泳過夜，電泳結(jié)束后銀染顯色并照相、分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 基因頻率和基因型頻率

等位基因頻率、基因型頻率、雜合度、純合度以及有效等位基因數(shù)用Arlequin軟件［18］計(jì)算，用POPGENE軟件［19］進(jìn)行哈代－溫伯格平衡（Hardy－Weinberg equilibriu m，H WE）檢驗(yàn)。用SPSS 17.0軟件（SPSS Science，Chicago，IL，USA）進(jìn)行PLIN基因型在兩個(gè)群體間分布差異的顯著性檢驗(yàn)。

1.5.2 多態(tài)信息含量

用多態(tài)信息含量（Pol y mor phis m Infor mation Content，PIC）估計(jì)PLIN基因的多態(tài)性，表示該基因的變異程度。PIC＞0.5為高度多態(tài)，0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)，PIC＜0.25為低度多態(tài)，利用Botstein等［20］的公式計(jì)算。

1.5.3 關(guān)聯(lián)分析模型

PLIN基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳效應(yīng)用SPSS 17.0軟件（SPSS Science，Chicago，IL，USA）中的一般線性模型（GL M）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GL M為：

式中：yijklm為性狀表型值，μ為總體均值，Bi為第i個(gè)品種效應(yīng)（i＝1，2），Sj為第j個(gè)性別效應(yīng)（j＝1，2），Mk為第k個(gè)月齡（k＝2，4，…，12），Gl為第l種基因型效應(yīng)，eijklm為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 PLIN 基因PCR－SSCP結(jié)果

對(duì)PLIN基因9個(gè)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外顯子3～6和8存在多態(tài)性（圖1），其中外顯子3、4、6檢測(cè)出了A、B兩個(gè)等位基因，三種基因型；外顯子5檢測(cè)出了A、B兩個(gè)等位基因，AA、AB兩種基因型；外顯子8檢測(cè)出了A、B、C三個(gè)等位基因，AA、AB、AC三種基因型。

圖1 PLIN 基因外顯子3、4、5、6、8擴(kuò)增產(chǎn)物PCR－SSCP電泳結(jié)果Fig.1 The PCR－SSCP of amplified products of PLIN gene

2.2 基因型頻率和等位基因頻率

兩個(gè)綿羊品種PLIN基因不同外顯子的基因型頻率和等位基因頻率見表2。在廣靈大尾羊和小尾寒羊兩個(gè)品種中，外顯子3、4、6中AA基因型頻率和A等位基因頻率都明顯高于BB基因型頻率和B等位基因頻率；外顯子5和8中A等位基因頻率顯著高于B等位基因頻率，未檢測(cè)出BB基因型；外顯子8中檢測(cè)出了AC基因型，未檢測(cè)出BB基因型，且C等位基因頻率顯著低于A等位基因頻率。

表2 兩個(gè)綿羊品種PLIN基因各外顯子的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequencies of exons in PLIN gene in two sheep breeds

PLIN基因不同多態(tài)位點(diǎn)的純合度（Homozygosity，Ho）、雜合度（Heter ozygosity，He）、有效等位基因數(shù)（Effective number of allele，Ne）以及H WE檢驗(yàn)、卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。廣靈大尾羊和小尾寒羊都是第5外顯子多態(tài)位點(diǎn)純合度最高；H WE檢驗(yàn)結(jié)果表明外顯子4多態(tài)位點(diǎn)在兩個(gè)品種中都不平衡，外顯子3多態(tài)位點(diǎn)在小尾寒羊群體中不平衡，而其他位點(diǎn)處于H WE。

卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)表明，外顯子3的基因型頻率在廣靈大尾羊和小尾寒羊品種間存在顯著差異（P＜0.05），而其他外顯子的基因型頻率無品種差異。

表3 PLIN基因各外顯子的遺傳多樣性指數(shù)和哈代－溫伯格平衡檢驗(yàn)Table 3 The genetic diversity indices and Hardy－Weinberg equilibrium test of PLIN gene

2.3 PLIN基因各外顯子的多態(tài)信息含量

除外顯子5外，其余4個(gè)外顯子的PIC介于0.25～0.5間，反映了以往并未對(duì)該基因進(jìn)行過高度選育，在兩個(gè)品種均呈中度遺傳多態(tài)；外顯子5的多態(tài)信息含量極低，遺傳一致性較高。

2.4 PLIN基因多態(tài)性對(duì)尾形和屠宰性狀的影響

不同品種、性別、月齡各因素各水平下尾形和屠宰性狀的均值和標(biāo)準(zhǔn)誤見表4。因未測(cè)小尾寒羊的尾脂重，難以確切地說明品種間的差異。但除屠宰率外，所有其他性狀均是廣靈大尾羊顯著地（P＜0.05）大于小尾寒羊，公羊大于母羊。這些結(jié)果也進(jìn)一步佐證了廣靈大尾羊的肉用性能優(yōu)于小尾寒羊。所有性狀月齡間差異顯著，且基本隨月齡的增大而增加。

表4 品種、性別和月齡對(duì)尾形和屠宰性狀的影響Table 4 Effects of breed，sex and month of age on tail and slaughter traits

在考慮上述各因素的同時(shí)，對(duì)PLIN基因的多態(tài)性與有關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果（表5）表明，外顯子4和6的多態(tài)性顯著影響相對(duì)尾脂重（P＜0.05），其中外顯子4的BB型個(gè)體（0.14）的相對(duì)尾脂重顯著大于 AA（0.11）和 AB型（0.09）個(gè)體；而外顯子6的AA型個(gè)體（0.13）的相對(duì)尾脂重顯著大于 AB（0.11）和 BB型（0.10）個(gè)體；外顯子5的多態(tài)性對(duì)尾寬的影響極顯著（P＜0.01），其中AA型個(gè)體（15.71 c m）顯著大于 AB型個(gè)體（10.86 c m）。

3 結(jié)論與討論

3.1 PLIN基因多態(tài)性

PLIN基因編碼的perilipin是一種脂滴相關(guān)磷蛋白，研究表明，perilipin磷酸化是激素敏感脂酶（HSL）從胞漿轉(zhuǎn)位至脂滴表面發(fā)揮脂解作用的必要條件之一［21］，在脂肪代謝中具有重要作用［6，7］。

Vykoukaloval等［14］對(duì)豬PLIN 基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，在外顯子2、3、5、6和7中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)突變、3種基因型，而本研究在外顯子3、4、6、8中都檢測(cè)出了3種基因型，在外顯子5中檢測(cè)出兩種基因型，且除外顯子5多態(tài)信息含量極低，其他外顯子在兩個(gè)品種均呈中度遺傳多態(tài)。比較而言，綿羊PLIN基因多態(tài)比較豐富，為綿羊良種的選育提供了一定的選擇空間。樊月圓等［15］檢測(cè)了秦川牛PLIN基因第3、4外顯子多態(tài)性，每個(gè)外顯子都發(fā)現(xiàn)了3種基因型，與本研究結(jié)果相近。這是否說明牛羊親緣關(guān)系相近，PLIN基因在該二畜種中的遺傳變異相似，尚待進(jìn)一步研究。

表5 PLIN基因多態(tài)性和尾形和屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 5 Associations bet ween the poly morphism of PLl N gene and tail and slaughter traits

3.2 兩個(gè)綿羊品種的遺傳差異

廣靈大尾羊主要分布在山西省的雁北地區(qū)，以產(chǎn)肉為主，肉用性能好，是蒙古羊進(jìn)入農(nóng)區(qū)后經(jīng)過長(zhǎng)期選擇、閉鎖繁育而形成的［16］；小尾寒羊主要分布于山東省的西南地區(qū)，主要特點(diǎn)是繁殖力高，但肉用性能一般，是蒙古羊進(jìn)入自然環(huán)境較好的中原地區(qū)，經(jīng)過長(zhǎng)期的自然和人工選擇而成［17］，因此品種間性狀和遺傳差異較大。本研究中，除屠宰率外，所有其他性狀均是廣靈大尾羊顯著地大于小尾寒羊，進(jìn)一步揭示了兩品種間的性能差異。

外顯子3在小尾寒羊中處于遺傳不平衡狀態(tài)，而在廣靈大尾羊中則平衡，并且PLIN基因外顯子3的基因型頻率品種間差異顯著（P＜0.05），這也進(jìn)一步證明了品種間遺傳差異的存在。廣靈大尾羊和小尾寒羊都是外顯子5的純合度最高，各外顯子的有效等位基因數(shù)品種間差異不顯著，且除外顯子3外，其他外顯子的基因型頻率無品種差異。這一方面表明起源相同的兩個(gè)綿羊品種在遺傳上具有一致性，另一方面也說明了基因的保守性。

3.3 PLIN基因多態(tài)性對(duì)綿羊尾形和屠宰性狀的遺傳效應(yīng)

動(dòng)物脂肪的沉積主要取決于脂肪細(xì)胞的體積與數(shù)量［22］，而PLIN基因編碼的perilipin對(duì)脂肪代謝具有重要的調(diào)控作用［2，3］，可以作為改善脂肪沉積的候選基因。人類以及畜禽上都發(fā)現(xiàn)了多個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)人的11482G＞A位點(diǎn)研究較多，且該位點(diǎn)主要與肥胖和血脂指標(biāo)相關(guān)［23］。趙小玲研究發(fā)現(xiàn)的3個(gè)SNP位點(diǎn)分別對(duì)肌內(nèi)脂肪含量、胸肌重和胴體重有顯著地遺傳效應(yīng)［24］。本研究中PLIN基因外顯子4和6的多態(tài)性對(duì)綿羊相對(duì)尾脂重影響顯著，外顯子5的AA型個(gè)體的尾寬極顯著地大于AB型個(gè)體（P＜0.01），進(jìn)一步說明了PLIN基因在綿羊脂肪沉積中的功能。與樊月圓等［15］研究結(jié)果一致，該基因可以作為影響胴體和肉質(zhì)的候選基因，指導(dǎo)肉用綿羊的育種工作。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)外顯子5和6中等位基因A都為群體中的優(yōu)勢(shì)等位基因，且含有A等位基因的個(gè)體，其相對(duì)尾脂重和尾寬顯著大于其他個(gè)體，表明這樣的個(gè)體脂肪沉積能力顯著優(yōu)于其他個(gè)體。由此，我們推測(cè)等位基因A可能影響綿羊的胴體和肉質(zhì)性狀，其結(jié)果還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，PLIN基因多態(tài)性對(duì)小尾寒羊和廣靈大尾羊的尾寬和相對(duì)尾脂重有顯著影響，具有沉積脂肪的功能，可以作為改善綿羊脂肪沉積能力、提高肉質(zhì)性狀的候選基因。有關(guān)結(jié)果可以指導(dǎo)肉用綿羊的遺傳改良，加快良種培育。

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