張宏平，張晉元，吳國良

（1.山西晉城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 晉城048026；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河南 鄭州450002）

桃（Amy gdal us persia L.）原產(chǎn)于我國黃河上游海拔1200～2000 m的高原地帶，是深受廣大人民喜愛的水果之一。它不僅外觀艷麗，肉質(zhì)細(xì)膩，而且營養(yǎng)豐富［1，2］。在桃研究方面，資料較多，從品種選育到栽培生理、從外觀的器官組織到微觀的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)［3～5］，但關(guān)于不同時(shí)期桃種皮組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)育情況、韌皮超微結(jié)構(gòu)及維管束結(jié)構(gòu)研究未見報(bào)道。本研究對(duì)桃種皮各個(gè)時(shí)期微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，以期為豐富干果類種皮微觀結(jié)構(gòu)和韌皮部糖卸載方式的研究作出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料采自山西省萬榮縣漢薛鎮(zhèn)南坡村董謀為果園。在桃各自的盛花期后每隔15天取一次材料，直到9月份果實(shí)成熟。電鏡觀察試驗(yàn)分別在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡室和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 透射電鏡樣品制備

組織包埋塊的制備參考張大鵬等［6］的方法，略有一些改動(dòng)。用雙面刀片將桃果實(shí)維管束組織切成2～3 mm3的小塊，用3%的戊二醛（用2 mol·L－1的磷酸緩沖液配制，p H 7.2）在4℃下前固定6 h，同時(shí)抽氣直到切塊下沉為止。1 mol·L－1磷酸緩沖液沖洗后，用1%鋨酸在4℃后固定過夜，用1 mol·L－1磷酸緩沖液沖洗后，4℃下系列乙醇脫水，純丙酮過渡，Spurr（Dow Chemical co，USA ）包埋，在68℃下聚合8 h。修塊后用LKB－8800型切片機(jī)切片（厚度為60～90 n m），醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染法染色，在透射電鏡（日立 H－7650和JEOL－1230）下觀察。

1.2.2 半薄切片樣品制備

在透射電鏡做好包埋塊的基礎(chǔ)上用KLB－V超薄切片機(jī)上半薄切片，厚0.3～0.5μm。將薄片挑入沾水滴的載玻片上，于60℃溫臺(tái)上烘干或?qū)⒉Ｆ趁嬷?jǐn)慎地溫火烘干，使切片粘貼于玻片上.采用亞甲藍(lán)／天青 A（p H 6.9）／番紅（p H 9.1）快速染色法［7］，水洗干凈，中性膠封片，用Oly mpus顯微鏡觀察并拍照。

2 觀察結(jié)果

2.1 桃種皮不同時(shí)期組織結(jié)構(gòu)

在桃果實(shí)發(fā)育成型時(shí)，桃種皮明顯的可以分為外、中、內(nèi)3層細(xì)胞，從早期到晚期，其細(xì)胞學(xué)上的變化相當(dāng)明顯。

在桃種皮發(fā)育早期，外種皮面積占到整個(gè)種皮橫截面的1／2還多，外種皮為11～13層，從外到內(nèi)細(xì)胞由大到小，由不規(guī)則到比較規(guī)則的橢圓形或圓形（圖1，A）。這層細(xì)胞的絕大部分為種皮薄壁細(xì)胞組成，其中貯存有滋養(yǎng)種胚發(fā)育的大量營養(yǎng)物質(zhì)。外種皮最內(nèi)的兩層細(xì)胞，細(xì)胞體積較小，細(xì)胞內(nèi)含物較多（圖1，A、B）。外種皮之內(nèi)為一層過渡層，過渡層細(xì)胞壁不均勻，靠近外種皮細(xì)胞壁比較厚，靠近中種皮細(xì)胞壁較薄，且過渡層細(xì)胞內(nèi)有黑色圓形顆粒狀物質(zhì)（圖1，A、B）。中種皮細(xì)胞為17～20層，細(xì)胞大小一致和排列相對(duì)整齊；在低倍光學(xué)顯微鏡下可觀察到，維管束分布于中種皮靠近內(nèi)種皮一側(cè)，并有規(guī)律的間隔一定數(shù)目的薄壁細(xì)胞出現(xiàn)一團(tuán)維管束。維管束在中種皮呈長條狀并排分布，篩管靠內(nèi)，導(dǎo)管靠外，屬于并列維管束（圖1，A、B）。在篩管附近的薄壁胞質(zhì)較濃，細(xì)胞排列緊密和胚更容易吸收營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)（圖1，B）。桃內(nèi)種皮由2層細(xì)胞組成，有兩類型的細(xì)胞，一種是細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)相對(duì)較少，細(xì)胞比較小，細(xì)胞之內(nèi)有黑色顆粒狀物質(zhì)，此種細(xì)胞組成了內(nèi)種皮的內(nèi)層；另一種細(xì)胞體積較大，細(xì)胞質(zhì)比較濃，有的甚至充滿了整個(gè)細(xì)胞，另外，部分細(xì)胞呈透明狀，內(nèi)種皮最內(nèi)一層由這兩種細(xì)胞間隔分布（圖1，A、B）。

桃種皮發(fā)育到中期，外種皮細(xì)胞形成“三明治”狀的細(xì)胞層，外種皮中間細(xì)胞層石細(xì)胞化，外種皮兩邊細(xì)胞層解體并木質(zhì)化，此時(shí)外種皮占整個(gè)種皮橫截面約1／6左右。過渡層細(xì)胞空洞化，細(xì)胞壁全部木質(zhì)化。中種皮細(xì)胞生長旺盛，大部分薄壁細(xì)胞都被細(xì)胞質(zhì)充滿，細(xì)胞間隙變小，并在中種皮零星的出現(xiàn)鞋狀的酚類細(xì)胞；維管束進(jìn)一步發(fā)育，在分布有維管束的中種皮部分，體積膨大呈現(xiàn)凸型（圖1，C、D）。內(nèi)種皮細(xì)胞的最內(nèi)層出現(xiàn)大的空泡，占據(jù)了細(xì)胞大部分體積，細(xì)胞質(zhì)被擠向邊緣，并出現(xiàn)一定數(shù)量的細(xì)胞壁被染成藍(lán)色的特殊細(xì)胞，其體積增大，細(xì)胞壁次生加厚很明顯，另外1～2層的細(xì)胞充滿黑色顆粒狀的物質(zhì)，逐漸轉(zhuǎn)變成大量的實(shí)心細(xì)胞（圖1，D）。

在桃種皮的末期，最明顯的特點(diǎn)有：各層細(xì)胞迅速解體，導(dǎo)致整個(gè)種皮的橫截面面積大幅度減小，細(xì)胞木質(zhì)化程度加重。外種皮的中間層進(jìn)一步高度木質(zhì)化，成為一石細(xì)胞層鑲嵌在外種皮中，外種皮各層細(xì)胞木栓化進(jìn)一步加深，相對(duì)整個(gè)種皮，其面積比例又增大了，占1／2左右（圖1，E、F）。過渡層細(xì)胞的空洞被木質(zhì)素類物質(zhì)充滿，形成完全木質(zhì)化的細(xì)胞層。中種皮靠近過渡層的細(xì)胞解體相當(dāng)明顯，其他薄壁細(xì)胞變長，有進(jìn)一步老化的趨勢；維管束形狀變化比較明顯，導(dǎo)管和篩管融為一體，不易區(qū)分，但整個(gè)種皮維管束及其周圍的薄壁細(xì)胞變化不大（圖1，E、F）。內(nèi)種皮細(xì)胞沒有解體跡象，細(xì)胞體積繼續(xù)增大，細(xì)胞空泡化進(jìn)一步明顯，兩層細(xì)胞大小懸殊，細(xì)胞間形成很大的胞間隙，推測可能參與形成了種皮和胚之間的自由空間（圖1，F(xiàn)）。

2.2 桃種皮超微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1 桃種皮薄壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

桃種皮早期時(shí)，薄壁細(xì)胞最典型的特征是細(xì)胞質(zhì)很豐富，大量的線粒體，典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，質(zhì)體，豐富的細(xì)胞質(zhì)，相當(dāng)發(fā)達(dá)的胞間連絲，顯示了細(xì)胞旺盛的生命活動(dòng)（圖2，A）。發(fā)育至中期，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙變大，大的液胞占據(jù)了細(xì)胞大量的空間，大量的淀粉粒、線粒體、大量致密的細(xì)胞質(zhì)被擠向細(xì)胞邊緣，細(xì)胞之間存在胞間連絲（圖2，B）。在末期，最明顯的是細(xì)胞間隙進(jìn)一步增大，大量細(xì)胞器降解，線粒體上的嗜鋨顆粒比較明顯，各種細(xì)胞器絮狀化并趨向模糊，出現(xiàn)大量囊泡，但還存在有較多的線粒體（圖2，C）。在末期外種皮細(xì)胞壁木質(zhì)化，細(xì)胞扭曲變形占據(jù)了細(xì)胞間隙（圖2，D）。

圖1 桃種皮組織結(jié)構(gòu)Fig.1 The tissue structure of seed pericarp about peach and almond

圖2 桃種皮超微結(jié)構(gòu)Fig.2 The ultrastructure of seed and fruit pericarp about peach

2.2.2 桃種皮SE／CC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)及與周圍韌皮薄壁細(xì)胞之間的細(xì)胞學(xué)聯(lián)系

桃果皮維管束韌皮部的SE／CC復(fù)合體中，CC細(xì)胞質(zhì)相當(dāng)濃，存在著大量的線粒體、質(zhì)體、囊泡和大量電子染色較深的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核比較大；SE細(xì)胞質(zhì)較少，細(xì)胞內(nèi)含物較少，只有散落在細(xì)胞中的部分細(xì)胞質(zhì)和囊泡，在細(xì)胞內(nèi)周緣也見少量的線粒體。SE／CC之間的胞間連絲在SE一側(cè)為單通道，而在CC一側(cè)為多通道分叉狀，整體來說SE比CC體積大或者相差不大。（圖3，B、D、E）。

在桃種皮維管束與其周圍薄壁細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察可知，韌皮部薄壁細(xì)胞和SE、CC，韌皮部薄壁細(xì)胞之間，SE／CC復(fù)合體相互之間存在大量的胞間連絲（圖3，A、C、E），SE／CC復(fù)合體之間的胞間連絲在結(jié)構(gòu)上與已有報(bào)告的資料相同，即SE一側(cè)是單通道，CC一側(cè)是多通道；CC與普通韌皮薄壁細(xì)胞是單通道的胞間連絲（圖3，B、D）。

圖3 桃種皮維管束結(jié)構(gòu)Fig.3 The vascular bundle ultrastructure of seed pericarp about peach

3 結(jié)論與討論

3.1 桃種皮組織結(jié)構(gòu)

桃種皮分為內(nèi)、中、外3層，外層11～13層細(xì)胞，中層17～20層，內(nèi)層2層。內(nèi)種皮由兩類細(xì)胞組成，一類是細(xì)胞質(zhì)相對(duì)較少，細(xì)胞內(nèi)有顆粒狀黑色物質(zhì)，一類細(xì)胞較大，細(xì)胞壁內(nèi)嵴突出成為特殊細(xì)胞。根據(jù)有關(guān)資料，這兩類細(xì)胞很可能是傳遞細(xì)胞，它們的功能均與物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有密切關(guān)系，因?yàn)樵诰S管束附近出現(xiàn)傳遞細(xì)胞研究報(bào)道的較多［8］，但其在發(fā)育過程的功能及作用有待于進(jìn)一步研究。第二類細(xì)胞在植物的根、莖、葉和生殖器官都有報(bào)道［8］，特別是生殖器官中的胚乳部位多有報(bào)道［8～10］，桃內(nèi)種皮的中后期是否作為種皮和胚的營養(yǎng)物質(zhì)和信息交流的橋梁、同時(shí)其在內(nèi)種皮出現(xiàn)的時(shí)間、不同時(shí)期的作用和功能結(jié)構(gòu)變化也有待于進(jìn)一步研究。

3.2 桃種皮薄壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

桃種皮薄壁細(xì)胞像大多數(shù)果實(shí)一樣［10～14］，早期細(xì)胞質(zhì)豐富，分布大量線粒體和質(zhì)體、典型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的胞間連絲。中期細(xì)胞體積增大，胞間隙變大，有大量淀粉粒、較多線粒體。末期胞間隙進(jìn)一步增大，大量細(xì)胞器降解，質(zhì)體上嗜鋨顆粒明顯，但存在較多線粒體，外種皮胞壁木質(zhì)化，細(xì)胞扭曲變形。這種現(xiàn)象與孫芳娟［15］觀察到的油桃在貯藏50 d后，細(xì)胞壁彎曲或皺縮，質(zhì)壁分離嚴(yán)重；細(xì)胞器變形或降解等現(xiàn)象相似。

3.3 桃種皮卸載方式

桃種皮SE與CC之間存在胞間連絲，SE／CC復(fù)合體與韌皮部周圍薄壁細(xì)胞間胞之間也存在發(fā)達(dá)胞間連絲，由此初步推測從桃種皮韌皮部經(jīng)共質(zhì)體方式卸載，再被轉(zhuǎn)移至胚用作種子的營養(yǎng)。這種卸載方式與核桃種皮和蘋果果實(shí)的卸載方式一致［11，16］，而與棗的卸載方式在早期是共質(zhì)體和末期是質(zhì)外體不一致［17］。另外，韌皮部卸載方式通過超微結(jié)構(gòu)觀察是其中的一部分工作，還需通過活體組織熒光示蹤和酸性轉(zhuǎn)化酶膠體金定位等實(shí)驗(yàn)方法來驗(yàn)證結(jié)果。

［1］汪祖華，莊恩及.中國果樹志·桃卷［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2001：74－76.

［2］俞德浚.中國果樹分類學(xué)［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：25－41.

［3］王富榮，趙劍波，佟兆國，等.桃種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2006，7（1）：118－122.

［4］林斌，張曉峰，余亞白，等.國內(nèi)外短低溫桃的研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（2）：280－284.

［5］牛良，王志強(qiáng)，劉淑娥，等.桃樹不同生長型及其研究進(jìn)展［J］.果樹學(xué)報(bào)，2004，21（4）：354－359.

［6］張大鵬，王毅.葡萄果實(shí)發(fā)育過程中果肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察［J］.植物學(xué)報(bào)，1997，38：388－39.

［7］徐是雄.植物材料的薄切片超薄切片技術(shù)［M］.北京：北京大學(xué)出版社，1981：6－32.

［8］初敬華.傳遞細(xì)胞［J］.生物教學(xué)，1994（11）：3－4.

［9］高榮岐.長豇豆胚和旺乳的發(fā)育及營養(yǎng)物質(zhì)積累［J］.植物學(xué)報(bào)，1992，34（4）：271－277.

［10］胡適宜，朱澂，徐是雄，等.豇豆胚胎發(fā)育早期的胚柄及胚乳中的傳遞細(xì)胞［J］.植物學(xué)報(bào)，1983，25：1－7.

［11］吳國良.核桃果實(shí)韌皮部卸載的細(xì)胞學(xué)路徑［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2004.

［12］張凌云.蘋果果實(shí)韌皮部質(zhì)外體卸載的證據(jù)［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2003.

［13］Peng Y B，Zhang D P.Ultrastructure of epider mis and flesh of the developing apple fruit［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2000，42：749－802.

［14］李治梅，張玉星，許建鋒，等.鴨梨、黃金梨果實(shí)結(jié)構(gòu)與耐貯性的關(guān)系［J］.果樹學(xué)報(bào)，2006，23（1）：108－110.

［15］孫芳娟，韓明玉，趙彩萍，等.不同采收成熟度油桃貯藏效果及果肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.果樹學(xué)報(bào)，2009，26（4）：450－455.

［16］Zhang L Y，Peng Y B，Sandrine P T，etal.Evidence for apoplasmic phloem unloading in developing apple fruit［J］.Plant Physiology，2004，135：574－586.

［17］聶佩顯，關(guān)秋竹，張振賢，等.冬棗果實(shí)韌皮部及其周圍薄壁細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察和功能分析［J］.電子顯微學(xué)報(bào)，2009，28（4）：389－395.